水分测定是药品生产和检验环节中一项极为关键的技术。中国药典附录将其单独列出，水分测定法中规定了卡氏法和甲苯法两种方法。但实际上，我们常用的水分测定方法有四种：干燥法、卡氏法、甲苯法（蒸馏法）以及气相色谱法（使用电导检测器）。不过，甲苯法和气相色谱法应用较少，操作也相对简单，因此本文主要探讨干燥法和卡氏法。

1. 干燥失重法

干燥失重法是药品生产和检验中最为常用的方法之一。在实验室中，干燥箱、减压干燥箱和减压干燥器是常用的设备；而在生产环节，红外/卤素水分测定仪则更为常见。

然而，干燥失重法本身是一种非专属性方法。它不仅可以检测水分，还会受到样品中残留溶剂（简称RS）的干扰。换句话说，干燥失重的结果等于水分加上残留溶剂。例如，一级对照品的含量可以通过以下公式计算：色谱纯度 - 干燥失重 - 炽灼残渣，或者用另一种方式表示：色谱纯度 - 水分 - 残留溶剂 - 炽灼残渣。

在欧美地区，如果产品中没有一、二类溶剂，其三类溶剂的检测可以使用干燥失重法，前提是LOD（最低检测限）不超过0.5%。这是因为0.5%是三类溶剂的可接受标准，在这种情况下，不需要区分0.5%的标准是来源于水分还是残留溶剂，这仅仅是一项符合性检查。但对于生产企业来说，强烈建议采用专属性方法检测残留溶剂，以确保对产品有更深入的了解。

不过，所有方法都有其前提条件。使用干燥失重法的前提是：

1.残留溶剂基本无干扰。

2.样品比较稳定，不会在干燥过程中发生分解产生挥发性物质。

3.样品中的水分能够充分挥发出来。

前两条相对容易理解，但第三条可能让人困惑。实际上，许多化合物本身就含有结晶水。例如，初中化学中常见的五水合硫酸铜，当它失去全部结晶水后，颜色会从蓝色变为白色。结晶水是化合物结构的一部分，去除它相对困难，且不同化合物去除结晶水的难易程度不同。例如，五水合硫酸铜在不同温度下会呈现不同的结晶水含量，其失水 - 温度曲线呈现楼梯状。

这意味着，在测定LOD时，结果可能只是游离水，也可能是总水（包括结晶水）。在研发制定方法时，需要明确想要得到的干燥结果。必要时，可以使用卡氏水分测定法来确定干燥后的水分状态，是含结晶水、不含结晶水，还是部分结晶水。简化处理的方法是不制定LOD标准，而是制定卡氏水分标准。

2. 水分测定的关键因素

1.LOD测定方法的关键因素

LOD测定方法的关键因素主要是温度和真空度。对于减压干燥而言，真空度是特定的，因此温度是真正的关键因素。一般来说，对于不含结晶水的化合物，105℃可以保证游离水的测定。但对于含结晶水的化合物，需要通过热重分析（TG）和/或卡氏水分测定来确定。

2.仪器/设备的确认

除了方法本身，所使用的仪器/设备也必须经过确认。确认的关键是温度。对于大型的恒温箱，需要进行温场分布测试；对于热天平等仪器，还需要进行天平的确认，包括日常校准，当然，由于数据量不是太大，每周或每月校准也是可以接受的。需要注意的是，有些设备不是空气循环加热的，而是采用加热板加热的，这时的温场分布就不能考虑整个箱体，而只能考虑加热板的一个平面。

3. 卡氏水分测定

1.基本原理

卡氏水分测定的基本原理是：在有二氧化硫和弱碱性化合物存在的情况下，水分子可以与碘分子定量地发生反应。通过测定反应所消耗的碘的量，就可以计算出样品中水分的含量。

2.构成卡氏滴定的试剂

卡氏滴定需要四种试剂：二氧化硫、弱碱、溶剂和碘。弱碱早期使用的是吡啶，但由于其有恶臭，现在一般使用的是咪唑；溶剂最常用的是无水甲醇，其主要原因是甲醇成本较低，且对大多数有机化合物具有较好的溶解性，因此被广泛应用。但甲醇在某些情况下也有缺点，不能使用，这将在后面进行描述。根据碘的来源不同，卡氏滴定可以分为两种：容量法和库仑法。容量法用于测定常量水分（一般认为5mg以上的含水量），碘的来源是将碘配制成滴定液，采用直接滴定的方法测定水分含量；库仑法则没有碘滴定液，碘分子是通过电解碘化钾产生的，用于微量水分测定（一般认为5mg以下的含水量）。

3.卡氏水分滴定的注意事项

容量滴定注意事项：由于滴定液是有机溶剂，存在易挥发和易吸水的情况，因此每次使用时应临用新标。包括更换新的一瓶滴定液时，要将整个管路进行润洗后再重新标定。为了节省滴定液，可以将开始一部分不外排，将管路末端插入滴定液瓶中打循环，但不建议这样做，因为这可能会对检测结果带来风险。库仑法不需要标定，因为它没有滴定液，但应定期进行确认。

空白干扰处理：虽然滴定要求在密闭的容器内进行，但这种密闭性不是绝对的。即使在环境条件比较稳定的情况下，仍会有水分透过密闭系统进入滴定体系中。这时需要在滴定系统平衡后，测定一段时间的漂移值，用以计算每分钟平均带来的干扰，再在样品滴定时计算进去（水分量减去平均每分钟漂移值与滴定时间的积）。由于样品在溶剂中溶解需要一定的时间，建议在滴定方法中设定一个混合时间（例如1分钟或2分钟，根据样品的溶解性来确定），再进行滴定，以确保滴定结果的重复性和准确性。另外，对于滴定终点的设定也是一个重要内容，有时药物可能会存在一些反应较慢的副反应，造成滴定后期漂移值较高降不下来，这时要考虑设置一个较高漂移值的终止参数或较短的终止时间，否则可能会造成检测结果偏高。

确认与标定：在实践中，大家往往使用纯化水进行滴定液的标定，但使用纯化水标定有一个缺陷，就是称样量太小（一般为10 - 20mg），而使用十万分之一天平往往达不到USP最小称量的要求（国内即使能达到误差也可能比较大）。实际上，国际上通用的水标准物除了纯化水以外还有两种：一种是市售的标准水（也可以自己配制，标定和稳定性研究后自己使用，如同工作对照品，但要密封保存，开封后当次使用），例如1mg/ml，这时标定时甚至可以使用移液管去定量移取；另一种是二水合酒石酸钠，可以买带证书的水标定专用试剂，这种试剂水含量是15.66%，这样就可以加大称样量以满足天平的要求，但这种试剂在甲醇中的溶解性较低，所以在仪器确认时要注意经常更换溶剂。另外，由于库仑法不需要进行标定，所以在使用时要经常使用标准水对仪器的准确性进行确认（使用不多的可以考虑每月/季确认一次）。仪器确认时要考虑准确性、精密度和线性，尤其是要考虑最小含水量的准确性，必要时可以考虑检测时降低滴定液的浓度。

缓冲体系：由于反应要求在一个弱碱性条件下进行，较大量的强酸或强碱性药物可能都会影响滴定的进行。对于这类药物，如果采用卡氏水分测定，在方法建立时必须考虑在溶剂体系中加入相应的缓冲剂以对抗药物本身对检测的影响。

副反应处理：这是卡氏水分滴定的关键一环。简单来说，就是：

1.凡是与碘可能发生化学反应的，包括氧化还原或络合，典型的如一些强还原剂；

2.凡是与溶剂发生反应生成水的。

对于第一种情况，包括上面提到的其他解决方案，就是将水分仪与小烘箱相连，烘箱加热所产生的水和溶剂通过导管转移到滴定杯中进行滴定。对于第二种情况，最典型的就是醛酮化合物，由于它可以与醇发生缩合反应而脱水，进而导致检测结果偏高。这种情况，一般来说解决的方案是使用醛酮专用滴定液和溶剂，最主要的是更换掉溶剂中的甲醇，当然它的缺点之一就是溶解性下降和成本提高。