摘 要 / Abstract
21 世纪以来，全球已发生3 次由冠状病毒感染引起的高致病性传染病疫情。其中，新冠病毒疫情规模空前，已造成数百万人死亡，给人类社会带来巨大冲击。接种疫苗是防控传染病的有效方法之一。目前，大部分疫苗开发商选择“以变应变”的策略（使用最新变异株的抗原位点）开发新冠疫苗。然而，疫苗开发的速度远远赶不上病毒变异的速度。笔者团队坚持采用“以不变应万变”的策略（使用原始毒株蛋白中保守的抗原位点）研发高效广谱抗沙贝冠状病毒或β属冠状病毒疫苗，以期更好地应对新冠病毒变异株以及未来新发与再现的β属冠状病毒疫情。
In the past 20 years, the world has witnessed three major outbreaks of highly pathogenic coronavirus infectious diseases. Among them, the COVID-19 pandemic is unprecedented, resulting in millions of deaths and a tremendous impact on global health. Vaccination is a key measure in the prevention and control of infectious diseases. At present, most vaccine developers adopt a "changeable-against-change" strategy (i.e., using antigenic sites of the latest variants) to develop COVID-19 vaccines. However, the speed of vaccine development lags far behind the pace of virus mutations. Our team has been adhering to a "non-changeable-against-changes" strategy (i.e., using conserved antigenic sites in proteins of the original virus strain) to develop highly effective broad-spectrum pan-sarbecovirus or β-coronavirus vaccines. This approach aims to better address the SARS-CoV-2 variants and future outbreaks of novel or recurring β-coronavirus pandemics.
关 键 词 / Key words
新冠病毒；严重急性呼吸综合征冠状病毒；中东呼吸综合征冠状病毒；沙贝冠状病毒；β属冠状病毒；广谱疫苗
SARS-CoV-2; SARS-CoV; MERS-CoV; sarbecovirus; β-coronavirus; broad-spectrum vaccine
2019 年12 月， 一场由严重急性呼吸综合征冠状病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2） 引起的新型冠状病毒感染（coronavirus disease 2019，COVID-19）疫情暴发并迅速蔓延， 成为全球公共卫生紧急事件[1]。据世界卫生组织（World Health Organization，WHO） 公布的数据， 截至2023 年11 月4 日，全球新冠确诊病例已超过7.7 亿例，其中近700 万例死亡，且病例数仍持续增加[2]。在21 世纪前20 年中，我们还经历过2003年由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒（SARS-CoV） 引起的传染性非典型肺炎疫情[3]，以及2012 年由中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome，MERS-CoV）引起的中东呼吸综合征疫情[4]。这3 种病毒均为β 属冠状病毒（β-CoV），对全球公共卫生及社会经济发展造成了严重威胁。
据统计，SARS-CoV-2的病死率约为0.9%， 明显低于SARS-CoV（9.6%） 和MERS-CoV（34.4%）[5-6]。由于SARS-CoV-2 感染者中无症状或轻症感染比例较高，该病毒的变异率更高、传播速度更快、传播范围更广[7]。此外，MERS-CoV 自2012 年流行至今仍未消失，如果MERS-CoV与SARS-CoV-2 重组形成MERS-CoV-2 或SARS-CoV-3， 有可能兼具MERS-CoV的高致死性和SARS-CoV-2 的高传播性，会给人类带来更大的危害[8]。也有研究表明，SARS 相关的蝙蝠病毒（SARS-related coronavirus，SARSr-CoV） 对人类血管紧张素转化酶2（human angiotensin converting enzyme 2，hACE2）有很高的亲和力，提示其具有跨物种传播的可能性[9]。在此背景下，为有效防控SARS-CoV-2及其变异株，以及未来新发与再现的β 属冠状病毒疫情，研发泛β-CoV 疫苗具有重要意义。
近20 年来，笔者团队致力于研发抗冠状病毒疫苗，先后报道多种抗SARS 和MERS 的候选疫苗。在新冠疫情暴发之后，团队基于已有经验和技术，采用“以不变应万变”的策略（选用原始毒株蛋白中保守的抗原位点设计疫苗），进一步聚焦于保守抗原位点和新型高效佐剂的研究，开发出首个基于新型佐剂的中广谱（pan-sarbecovirus）疫苗和大广谱（pan-β-CoV）疫苗候选。本文将对近年来广谱冠状病毒疫苗的研发策略及成果进行总结，期望为进一步研发大广谱或超广谱（pan-CoV）冠状病毒疫苗提供参考。
1、概 述
1.1 冠状病毒的分类
冠状病毒属于套式病毒目（Nidovirales） 冠状病毒科（Coronaviridae）正冠状病毒亚科（Orthocoronavirinae）， 是单股正链RNA 病毒。其包膜上有形似皇冠的棘状突起，由此得名[10]。根据基因组和血清学特点，冠状病毒可分为α、β、γ、δ四大属，已知可以感染人类的冠状病毒（human coronavirus，HCoV） 有α和β 属， 而γ 和δ属主要感染禽类[11]。α 属冠状病毒包括HCoV-229E 和HCoV-NL63等，可引起普通感冒症状[12]。β 属冠状病毒可再分为A、B、C、D 四个谱系。其中，A 谱系包括HCoV-OC43 和HCoV-HKU1，致病力较弱；B 谱系也称沙贝冠状病毒（sarbecovirus），包括SARS-CoV、SARS-CoV-2 以及SARSr-CoV， 前两者感染可造成严重急性呼吸综合征；C 谱系又称玛贝冠状病毒（merbecovirus）， 包括MERS-CoV 和MERS 相关的蝙蝠病毒（MERSr-CoV） 等，也具有较强的致病性[13]。
随着新冠疫情的持续传播，SARS-CoV-2 已演化出众多变异株。WHO 把具有较强传播与免疫逃逸潜力的毒株归为值得关切的变体（variants of concern，VOC），包括Alpha、Beta 、Gamma、Delta和Omicron。其中，Omicron 是目前主要流行的毒株，其传播复杂且隐匿，可进一步分为BA.1、BA.2、BA.3、BA.4、BA.5 五个亚谱系[14]。亚谱系根据基因序列的细微差异，又衍生出多个进化分支，如XBB.1.5、EG.5、BA.2.86、BQ.1.1、BF.7.14 等。变异株的不断涌现，使现有疫苗的有效保护率明显下降，甚至可能导致注射疫苗者及既往感染者所建立的免疫屏障失效，增加突破性感染和再感染的风险。因此，需要研发安全有效的广谱抗冠状病毒疫苗，以应对目前流行及未来可能出现的冠状病毒疫情。
1.2 新冠病毒的结构
新冠病毒由包膜、单链RNA及多种蛋白组成。其基因组编码4 种主要的结构蛋白，包括病毒表面的刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M），以及在病毒内部的核衣壳蛋白（N）[15]。其中，S 蛋白在受体识别和结合以及膜融合和病毒进入宿主细胞的过程中发挥重要作用，是疫苗研发的主要靶点[16]。
S 蛋白以同型三聚体的形式存在， 每个单体由S1 和S2亚基组成。S1 亚基包含信号肽（signal peptide，SP）、N 端结构域（N-terminal domain，NTD）和C 端结构域（C-terminal domain，CTD）。CTD 内含有受体结合域（receptor-binding domain，RBD）， 后者是一个重要的功能域，能够识别并结合hACE2，引起S 蛋白构象改变[17]。RBD 是开发新冠疫苗常用的免疫原，然而RBD 的中和表位易发生突变，大大削弱了现有疫苗的效果[18]。因此，研究者们积极寻找RBD 的保守区域，目前已揭示了隐藏在三聚体内部的RBD高度保守表位，在新冠病毒高频突变株中均无突变，这对于广谱疫苗的开发具有很好的借鉴意义[19]。
S2 亚基由融合肽（fusion peptide，FP）、七肽重复序列（heptad repeat，HR）1 区（HR1） 和2 区（HR2）、中心螺旋区（central helix，CH）、连接域（connection domain，CD）、茎螺旋区（stem helix，SH）、跨膜区（transmembrane region，TM）、细胞质结构域（cytoplasmic domain，CP）组成。其中，HR1 和HR2 相互作用形成六螺旋束（6-HB），是介导病毒膜融合的关键步骤[20]。也有一些研究发现，靶向SH 区的中和抗体对β 属冠状病毒有广谱中和作用[21-23]。此外，FP 区在所有冠状病毒中属中高度保守区域，目前已发现靶向该表位的抗体对α、β 属冠状病毒均有良好的中和活性[24-26]。在S 蛋白融合前构象中，S2 亚基上的中和位点并不充分暴露，其序列比S1 亚基更为保守[27]。因此，S2 亚基上的HR1、HR2、SH、FP 结构域是开发广谱冠状病毒疫苗的重要靶点。
2、已获批的新冠病毒疫苗
接种疫苗是应对感染性疾病的有效防控手段之一。WHO 公开数据显示，截至2023 年11 月25 日，全球疫苗接种超过136 亿剂[2]。新冠疫苗种类繁多，大致可分为灭活疫苗、减毒活疫苗、重组蛋白亚单位疫苗、核酸疫苗、重组腺病毒载体疫苗、病毒样颗粒疫苗六大类。
目前， 已有12 种新冠疫苗（被称为“第一代新冠疫苗”）获WHO 紧急使用授权，包括4 种病毒载体疫苗、3 种灭活疫苗、3 种重组蛋白亚单位疫苗、2 种mRNA 疫苗[28]。在新冠疫情暴发后仅一年多的时间里，新冠疫苗便被陆续开发并投入使用，显著降低了原始毒株感染者的重症和死亡发生率，挽救了成千上万条生命。然而，后续研究发现第一代新冠疫苗存在低效、短效、窄谱的缺陷，不能有效地预防新冠病毒及其变异株的感染和传播[29]。其主要原因在于，第一代新冠疫苗通常使用中和免疫原性较差的疫苗抗原，如S 蛋白或灭活病毒颗粒[30]。虽然这些抗原中也含有RBD，但其中的中和位点未能充分暴露并保持适当的空间构型。这些抗原中还含有多个非中和抗体免疫优势区，其诱导的大量非中和抗体或有害的抗体反应可干涉或压抑中和抗体反应[31]。
不断出现的新冠病毒变异株产生严重的免疫逃逸， 对于使用原始毒株蛋白抗原开发的第一代新冠疫苗和抗体药物几乎完全不敏感。很多研究团队或疫苗开发商采用“以变应变”（根据变异株蛋白序列重新设计疫苗） 的策略开发新一代的疫苗， 但其开发速度总是赶不上新冠病毒变异的速度， 导致最新变异株迅速向全球蔓延。因此， 为更好地对抗病毒持续变异造成的威胁， 扭转“ 以变应变”的被动局面，应当采取“以不变应万变”（选用原始毒株蛋白中保守的抗原位点设计疫苗）的策略， 研发高效广谱的泛沙贝冠状病毒或泛β 属冠状病毒疫苗， 从而有效地预防新冠病毒及其变异株和其他β 属冠状病毒的感染、传播与流行。
3、广谱抗冠状病毒疫苗研究策略
新冠疫情暴发之初，笔者团队就呼吁研发高效、广谱的抗冠状病毒疫苗，来应对新冠病毒可能出现的变异[32]。根据效用范围，抗冠状病毒疫苗可分为小广谱、中广谱、大广谱、超广谱这四类。小广谱疫苗， 即泛新冠病毒（pan-SARS-CoV-2） 疫苗，对新冠病毒及其变异株有效， 如将Omicron 变异株的S蛋白添加至针对原始毒株的疫苗中制得的多价疫苗[33]。中广谱疫苗，即泛沙贝冠状病毒（pan-sarbecoviruses）疫苗，在小广谱的基础上还需对SARS-CoV和SARSr-CoV 有效。WHO 在2022 年召开紧急会议，向全世界呼吁要尽快开发泛沙贝冠状病毒疫苗（中广谱疫苗），以防控新冠疫情及未来可能出现的SARS 样传染病。目前，针对中广谱疫苗的开发策略主要包括纳米颗粒抗原载体、嵌合mRNA 疫苗、增强免疫反应的新型佐剂等[34]。大广谱疫苗， 即泛β 属冠状病毒（pan-β-CoV） 疫苗， 对β 属各谱系冠状病毒均有效，这是未来疫苗研发的主攻方向，不仅能够控制目前流行的新冠病毒及其变异株感染，还可预防未来可能出现的其他β 属冠状病毒的流行。超广谱疫苗，即泛冠状病毒（pan-CoV）疫苗，能够抗7 种已知的人冠状病毒。由于这些病毒的RBD 序列与结构存在较大差异，超广谱疫苗开发充满挑战。
3.1 RBD-Fc 二聚体
受体结合域（RBD） 位于S1 亚基上，能够与人呼吸道上皮细胞表面ACE2 受体特异性结合，促进病毒入侵宿主细胞。在SARS 流行期间，笔者团队在国际上首次报道SARS-CoV 的S 蛋白中的主要中和抗体表位位于RBD[35]。使用RBD-Fc 二聚体（将人的IgG Fc 片段连接到RBD 所形成的重组蛋白）免疫小鼠和兔子，其血清的中和抗体滴度高达10 000 以上[36]。使用RBD-Fc 二聚体免疫小鼠的淋巴细胞制备出25 株高中和效价的单克隆抗体，用这些单抗检测发现RBD 上存在6 种不同构象的中和表位[37]。从SARS-CoV 灭活疫苗免疫的动物血清和SARS-CoV感染者血清中分离的中和抗体，主要作用于RBD[38]。因此研究者认为，RBD 是研发SARS-CoV疫苗和抗体药物的最重要的靶点，并在此后研发出一系列靶向RBD 的抗SARS-CoV、MERS-CoV 和新冠病毒的候选疫苗及中和抗体[39-42]。
截至目前， 多个研发团队基于RBD 的疫苗研发已取得积极进展。例如，智飞生物与中国科学院微生物研究所联合开发的RBD 二聚体疫苗（ZF2001），成为国际上首个注册上市的重组亚单位新冠疫苗[43]。丽珠医药与中国科学院生物物理研究所合作研发IFN-Pan-RBD-Fc 融合蛋白疫苗（V-01），Ⅲ期临床试验结果证明其可有效预防Omicron变异株[44]。四川大学华西医院魏于全院士团队研发的新冠病毒RBD 疫苗（威克欣）是全球首款使用昆虫（Sf9）细胞生产的重组亚单位新冠疫苗[45]。他们在此基础上进一步开发成功的重组三价新冠病毒（XBB+BA.5+Delta 变异株）RBD 三聚体蛋白疫苗现已纳入紧急使用，可在我国多个大城市对于重点人群进行加强免疫接种。这些成果再次证明了RBD是研发冠状病毒疫苗和抗体的最佳靶点之一。
天然RBD 以三聚体形式存在， 为何将Fc 连接到RBD 所形成的RBD-Fc 二聚体能够比RBD 单体或三聚体诱导出更高效、更广谱的中和抗体反应？研究表明，RBD-Fc 二聚体可以通过Fc 结合到抗原提呈细胞（APC）上的Fc 受体，促进RBD 抗原的捕获和提呈，从而发挥分子内佐剂效应；能够提高抗原的分子量、半衰期和稳定性，诱导产生更高效的中和抗体反应[46-48]。RBD-Fc自动形成的二聚体结构能够充分暴露隐藏在RBD 三聚体中的保守中和表位，从而诱导更广谱的中和抗体反应[19]。
3.2 加帽法或脱帽法
RBD 含有能诱导强烈中和免疫反应的表位，因而被作为病毒亚单位疫苗的重要靶点。但其中也含有一些可诱导非中和抗体的免疫显性区域，而病毒就能够利用这些非中和表位来转移宿主的免疫反应，导致免疫逃逸[49-50]。
笔者团队通过两种方式对重组RBD 疫苗进行优化。一种是“加帽法”，即添加糖基化氨基酸遮盖RBD 中的免疫优势非中和表位。通过引入中和免疫原性指数（neutralizing immunogenicity index，NII） 和广谱中和免疫原性指数（broad neutralizing immunogenicity index，BNII）的概念来评估单个表位的免疫原性， 筛选出MERS-CoV RBD中一个免疫显性非中和表位Thr579，引入聚糖探针掩盖这一表位（T579N），可以增强RBD的中和活性及其对免疫小鼠的保护效力[40]。另一种是“脱帽法”，即去除糖基化氨基酸来暴露RBD中的保守中和抗体表位。团队构建了一系列脱糖基化的SARS-CoV RBD 蛋白抗原， 并发现了其中一种脱糖基化RBD 蛋白（RBD219-N1）在免疫小鼠中诱导更强的RBD 特异性抗体反应和更高的中和抗体水平[51]。这些结果表明，通过引入或去除糖基化氨基酸，掩盖免疫优势非中和性表位或暴露中和表位，将宿主的免疫反应集中到保守的中和表位上，为设计更高效而广谱的抗病毒亚单位疫苗提供了思路。
3.3 含有能充分暴露新冠病毒RBD 的class 3 和（或）class 4 中和表位的疫苗
新冠病毒S 蛋白三聚体由3个相同单体组成，RBD 位于每个单体的尖端。RBD 从“ 向下（down）”状态翻转为“向上（up）”状态， 在此处暴露出一段受体结合基序（receptor-bindingmotif，RBM）。RBM 是RBD的主要功能区域，能够直接识别并结合ACE2，介导病毒入侵。在S 蛋白融合前构象中，RBM已经暴露在外，因而具有较高的突变率[52]。
根据抗体与RBD 的结合模式， 抗RBD 抗体可分为4 类（class 1~4）[53]。class 1 靶向RBM， 只能结合处于“up” 状态的RBD， 代表性抗体包括REGN10933、CB6 等；class2 也靶向RBM， 可结合处于“up”或“down”状态的RBD，如CT-P59、LY-CoV555 ；class 3 的表位位于RBM 之外，属于非ACE2 竞争性抗体， 如DH1047、S2X259 ；class 4针对RBM 远端的保守表位，对多种冠状病毒具有交叉反应性，代表性抗体有LY-CoV1404、S309。相比于高度可变的class1 和class 2 的中和表位，class3 和class 4 的中和表位更加保守。特别是class 4 的中和表位，在自然状态下存在于RBD 三聚体中心部位，不能充分显露[54]。因此，研究人员用RBD 序列随机排列的方式暴露保守表位，从而诱导产生广谱的交叉中和抗体反应[55]。也有研究者设计构建了靶向class 3 和class 4 的中和表位小分子全人源纳米抗体，能够钻入三聚体内部并与隐藏的保守表位相结合，强效中和新冠病毒所有流行突变株[19]。这些方法为开发更为广谱的新冠病毒疫苗与疗法提供了新的思路。
3.4 高变异抗原的趋同突变和保守表位的S 蛋白
新冠病毒作为RNA 病毒，在复制过程中往往容易发生基因的随机突变。这些突变不断累积以逃避免疫，导致人群在接种疫苗后出现突破性感染[56]。若能在新冠病毒庞大的进化图谱中找寻出规律，预测病毒的演变方向，则有助于设计和构建广谱抗冠状病毒疫苗。
研究人员对超过1000 万个新冠病毒序列进行进化分析，发现新冠病毒S 蛋白的突变并非完全随机，而是遵循3 条路径定向分化：一是高感染性和低免疫逃逸能力（如Delta 变异株）；二是低感染性和高免疫逃逸能力（如Gamma 变异株）；三是高感染性和高免疫逃逸能力（这一路径比较少见，如Beta 变异株）。在此基础上，研究人员对NCBI 数据库中2675 个新冠病毒S 蛋白作进化聚类和结构扫描，得到高变异S 蛋白的共性突变以及保守表位，据此设计出一种泛新冠病毒S 抗原（Span）。Span 疫苗能够诱导小鼠产生更高效广谱的中和抗体，甚至能有效降低后来出现的Omicron 变异株感染者的病死率[57]。这一结果表明，病毒进化分析可以为新冠病毒通用疫苗设计提供可靠依据，对抗现有及未来可能出现的流行变异株。
3.5 含有HR1 和HR2区段的广谱新冠病毒疫苗
HR1 和HR2 位于S2 亚基，两者形成的六螺旋体结构促进膜融合。在20 世纪90 年代初，笔者团队发现衍生于HIV-1 gp41的HR2 区的多肽SJ-2176 能高效抑制HIV-1 的融合和入侵[58]。机制研究发现，HR2 多肽能够结合HIV-1 gp41 的HR1 区， 竞争性地抑制病毒的HR2 与HR1结合形成6-HB，从而阻止HIV的融合与入侵。这一发明专利转让给美国Trimeris 公司， 开发出全球首个基于病毒融合抑制剂的抗HIV 多肽药物—— 恩夫韦肽（Enfuvirtide， 又称T20）。由重组蛋白N36Fd[59] 和HR1–HR2–HR1 串联蛋白（HR121）[60]所形成的三聚体能够模拟gp41融合中间体的HR1 三聚体，与HIV-1 gp41 的HR2 结合，竞争性地抑制病毒的HR1 与HR2 结合形成6-HB，从而阻止HIV 的融合与入侵。
在新冠疫情出现后，研究人员借鉴抗HIV 药物开发的经验，针对新冠病毒S 蛋白S2 亚基的结构设计了重组蛋白HR121。研究证明，HR121 可抑制新冠病毒膜融合，且能够在免疫动物体内诱导生成针对新冠病毒及其变异株（尤其是Omicron）的广谱中和抗体[61]，表明HR121 重组蛋白有潜力被开发为靶向新冠病毒S2 亚基HR1 区中保守中和表位的抗新冠病毒及其变异株的广谱疫苗，有很好的开发前景。
3.6 含有SH 区段的广谱疫苗
茎螺旋区（SH）位于S2 亚基上， 深藏于S 蛋白三聚体内部。美国斯克利普斯（Scripps）研究所的研究团队从新冠康复者血清中分离出一系列交叉反应抗体，发现这些抗体与多种β 属冠状病毒有不同程度的交叉反应[62]。其中，CC40.8 抗体能同时中和SARS-CoV 和SARS-CoV-2，结构分析得知CC40.8主要结合S 蛋白的SH 区段[21]。后续进一步研究也发现了一些靶向SH 区段的人源抗体（ 如S2P6、CV3-25）， 表现出对β属冠状病毒的广泛中和活性[22-23]。SH 区不仅在BQ.1.1、XBB 等Omicron 变异株上高度保守，还在数十个新冠高频突变株上未发生突变[63]。因此，SH 区段是设计泛β 属冠状病毒疫苗的关键靶点，对广谱疫苗的开发具有很好的借鉴意义。
3.7 含有FP 区段的广谱疫苗
融合肽（FP）位于S2 亚基N 端。只有当S 蛋白与受体结合时，FP 区段才能够暴露出来，因此这一区段具有较高的保守性。研究者采用经典的单个B 细胞技术，从新冠康复患者外周血中分离出S 蛋白特异性记忆B 细胞，获得其抗体序列，由此制备出一系列人源抗体，再通过表位筛选，得到一株广谱抗体（76E1）。研究表明，76E1 可以广谱中和7种人类冠状病毒（HCoV）， 且对部分γ 和δ 属冠状病毒也表现出一定的中和活性[24]。随后发现的COV44-62、COV44-79、VN01H1、C77G12 等抗体也靶向FP 区段，对多种β 属冠状病毒有中和作用[25-26]。该系列研究表明，融合中间构象暴露的FP区段在冠状病毒中高度保守，这使超广谱疫苗的研发成为可能。
3.8 含有HR1、CH、SH 区段的广谱冠状病毒疫苗
S2 亚基的相对保守性使其成为广谱疫苗的重要靶点。HR1、CH、SH 均位于S2 亚基。在S蛋白与宿主细胞融合后构象中，HR1 与CH 形成三螺旋体，SH位于CH 附近。笔者团队对这3个区域进行保守序列分析，设计合成了3 种重组蛋白——HR1、HR1S 和HR1LS。它们都可以形成稳定的α 螺旋三聚体，能与病毒的S2 亚基HR2 区竞争性结合，阻止病毒6-HB 的形成，从而抑制新冠病毒及其变异株以及其他β 属冠状病毒的融合及入侵。其中，HR1LS 效果最优。使用HR1LS 免疫小鼠，能够诱导产生较高滴度的中和抗体，可有效中和SARS-CoV-2 及其变异株（ 如Delta 和Omicron） 和其他β 属冠状病毒（如SARS-CoV、MERS-CoV 及相关蝙蝠病毒MjHKU4r-CoV-1）， 以及α 属冠状病毒（ 如HCoV-229E、HCoV-NL63） 感染[64]。因此，HR1LS 三聚体具有开发成超广谱冠状病毒疫苗的潜力。
3.9 安全高效的佐剂
非特异性免疫增强剂简称佐剂（adjuvant），是亚单位疫苗的重要组成部分[65]。佐剂与抗原共同或预先被注入体内，能够促进强效而持久的免疫应答。常见的佐剂有铝佐剂、MF59、AS04、AS03、AS01、CpG1018 等。其中，铝佐剂是世界上最早也是最广泛使用的佐剂。其虽具有较高的安全性，但不易激活细胞免疫反应，因此在应用上有局限性[66]。为提高亚单位疫苗效力，需要寻找能够安全、有效促进体液和细胞免疫应答的新型佐剂。
干扰素基因刺激因子（STING） 通路激动剂能够激活STING， 诱导Ⅰ型干扰素（IFN-Ⅰ） 反应和产生促炎细胞因子[67]。cGAMP 是天然的STING 激动剂[68]。2020 年，笔者团队与哈佛医学院Wu 教授团队合作， 设计出一种基于cGAMP 的肺部仿生纳米颗粒佐剂（PS-GAMP）， 它可有效促进疫苗产生高效的体液和细胞免疫反应，从而保护免疫动物抵抗多种异型流感病毒的攻击[69]。2022 年，团队筛选出新的小分子STING 激动剂CF501，发现其对于RBD-Fc 亚单位疫苗具有超强的免疫增强效应[70]。研究者将RBD-Fc/CF501 疫苗注射入小鼠体内发现，其诱生的中和抗体滴度比RBD-Fc/ 铝佐剂疫苗诱生的中和抗体滴度高出近20 倍。用RBD-Fc/CF501疫苗免疫猴子半年后，其抗血清对21 个SARS-CoV-2 变异株（ 包括Alpha、Beta、Gamma、Delta、Omicron）、41 个天然变异株、SARS-CoV 及其变异株，以及多个蝙蝠SARSr-CoV（如WIV1、Rs3367、RsSHC014）都表现出强大的中和抗体反应。同时，RBD-Fc/CF501 疫苗也能诱导高效的特异性T 细胞反应，还能有效保护恒河猴免受新冠病毒的攻击。这表明RBD-Fc/CF501 可被进一步开发为泛沙贝冠状病毒疫苗，用于防控新冠病毒变异株及将来新发与再现的SARS 相关传染病的流行，这也验证了基于“以不变应万变”策略研发广谱冠状病毒疫苗的可行性。此后，团队又用重组蛋白HR1LS 与CF501 佐剂共同免疫小鼠，血清抗体滴度比HR1LS/铝佐剂组高4 倍左右，进一步证实了CF501 的强效佐剂效应[64]。在基于病毒保守区设计和优化免疫原的同时，对佐剂进行升级，探索“抗原+ 佐剂”的最佳组合，或许能够起到“1+1>2”的效果，提高“以不变应万变”策略研发广谱疫苗的成功率。
4、总结与展望
21 世纪以来，全球共发生3次高致病性冠状病毒疫情，分别由SARS-CoV、MERS-CoV和SARS-CoV-2 引起，它们均为β 属冠状病毒。冠状病毒传染途径多、传播速度快、影响范围广，在短期内即造成大规模流行，导致感染者出现呼吸系统症状及全身症状，严重者发生呼吸困难、休克、甚至死亡。2019 年年底暴发的新冠疫情，至今仍在全球范围内流行，截至2023 年11 月4日，感染病例数高达7.7 亿，对人类健康、经济发展和社会稳定造成巨大威胁。冠状病毒变异速度快、进化分支庞大，疫苗开发的速度远赶不上病毒变异的速度，导致疫情蔓延不止。并且，新发与再现的冠状病毒疫情还可能发生，亟须研发安全、高效的广谱抗冠状病毒疫苗，防“疫”于未然。
目前，已获批上市或授权紧急使用的第一代新冠疫苗包括灭活疫苗、重组蛋白亚单位疫苗、病毒载体疫苗、mRNA 疫苗等多种类型，均表现出良好的安全性，在降低感染者重症率和死亡率方面起到了关键作用。然而，第一代新冠疫苗存在中和免疫原性低、免疫效期短、广谱性差等缺陷。笔者和其他团队在研发广谱冠状病毒疫苗的过程中注意到，新冠病毒S1 亚基RBD 功能区以及S2 亚基HR1、SH、FP 功能区中保守的抗原位点是重要的疫苗靶点。但同时，相关疫苗开发面临着“广谱不高效、高效不广谱”的困境。如何同时实现广谱和高效，是亟须解决的关键科学问题。由此，笔者团队研发出了新型佐剂CF501，与先前设计合成的RBD-Fc、HR1LS 蛋白抗原联用， 分别得到RBD-Fc/CF501 和HR1LS/CF501 候选疫苗。两者在免疫动物诱导产生的中和抗体滴度和T 细胞免疫强度均明显高于RBD-Fc/铝佐剂和HR1LS/铝佐剂疫苗组，且更长效、更广谱。其中，RBD-Fc/CF501 疫苗是第一个基于新型佐剂的高效广谱泛沙贝冠状病毒（中广谱） 候选疫苗，HR1LS/CF501 疫苗是第一个基于新型佐剂的广谱泛β 属冠状病毒（大广谱）候选疫苗。两款疫苗一旦开发上市，有望更有效地应对当前流行的新冠病毒变异株和未来新发或再现的冠状病毒疫情。
新冠病毒变异株及其亚变体层出不穷，使得疫苗开发商不断开发针对最新变异株的下一代疫苗，但部分人群在接种多剂“新疫苗”后仍频发突破性感染。这一现象表明，使用“以变应变”的策略开发疫苗总是处于被动状态，难以建立起坚固、持久的广谱免疫屏障，这更加凸显出研发高效、广谱抗冠状病毒疫苗的必要性。笔者团队始终坚持“以不变应万变”的策略，致力于寻找更加保守的抗原表位，通过结构设计使其充分暴露，并添加新型高效佐剂来提高疫苗的免疫原性及广谱性。这些高效、长效、广谱冠状病毒疫苗如能开发上市，不仅是遏制当前新冠疫情的利器，更将成为预防未来冠状病毒感染的坚硬盾牌。
