前言

有关物质方法较含量测定而言是一个更加复杂和琐碎的体系，含量测定仅要求准确分析主成分，有关物质方法需要研究所有可能的杂质，同时对未知杂质也要进行适当分离。

然而，研究过程复杂多变，每个杂质有它的脾气，在开发过程中，又会有很多未知因素左右，在基于自然科学的基础上，需要及时识别异常事件对方法的影响，避免掉入坑里，久久不能自拔。

下面笔者根据多年的实践经验来分析方法开发过程中的细节。

1、仪器状态

目前主流的高效液相色谱仪有Waters、Agilent、Shimadzu、Thermofisher，这些品牌之间在设计、布局、耐压等有所区别，各有特点，同时有常规液相和超高效液相(Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC)。

Waters

Shimadzu

Agilent

Thermofisher

对于新仪器而言，出厂经过严格的质检，同时安装后会进行“3Q”验证，确保仪器的各项指标均是正常的，一般来说进行方法开发、验证以及转移问题不大。然而，对于二手仪器而言，是需要多留一个心眼。当下经济下行，投融资环境恶劣，生物医药正在经历一场寒冬，很多公司在仪器采购时，倾向于二手仪器。由于二手仪器鱼龙混杂，有的设备用了5年，有的10年，甚者还有20年。那么在方法转移时，如果你是采用的二手仪器开发的方法，接收方为全新的仪器，那么这时需要评估风险，尤其有关物质方法比较复杂，主峰与相邻杂质距离非常近。笔者曾经遇到过这种情况，二手仪器之前维修过，部分管路由不锈钢换成peek管，没有按原有长度替换，导致与转入方仪器的死体积不一致，最后通过测量长度，把过长的部分截掉，重新调整梯度优化方法，完成方法转移。

2、仪器死体积

1、死体积指的是有效进样点到有效检测点之间排除色谱柱中包含固定相部分的体积。包括 4 部分：

进样器至色谱柱管路体积

柱内固定相颗粒间隙（被流动相占据，Vm）

柱出口管路体积

检测器流通池体积。

其中只有 Vm 参与色谱平衡过程，其他3部分只起峰扩展作用。为防止峰扩展，这3部分体积应尽量减小。

2、系统死体积一般通过进样基本不保留的小分子来测定。尿嘧啶、丙酮和硫脲是反相色谱中最常用的测试物质；死时间与死体积相关；可以用死体积除以流速测定。

3、管路若需要更换，尽量采用相同内径及长度的管路进行替换，确保方法的重现性。

4、另外接装色谱柱时，需确保管线接头匹配完好（特别注意peek管接头的使用，以及管线与色谱柱的连接处）避免形成接头空腔（如下图）

5、若产生接头空腔，会增大系统死体积，同时会导致色谱峰展宽，影响峰形及分离度。

3、色谱柱载碳量

同样是C18色谱柱，不同品牌的色谱柱千差万别，其中载碳量是一个很重要的参数，一般C18色谱柱的载碳量参数是在10%~20%之间，载碳量越高，保留及分离能力越强，因此，在做方法学验证耐用性-不同品牌色谱柱时，需要关注载碳量是否有明显的区别。

4、鬼峰

辅料在制剂中使用非常广泛，然而很多辅料是惰性的，在溶剂中无法溶解，因此样品前处理时可能需要离心或过滤，对于溶解性能强的溶剂，需要注意在样品前处理时，滤膜、过滤器或离心管是否有未知物被溶解，导致产生未知色谱峰；笔者曾经做过一个片剂的项目，制剂中总是会固定出现一个未知杂质峰，忽大忽小。经过调查发现是注射器的原因，将塑料注射器更换为玻璃注射器后，未知杂质峰（鬼峰）完全消失，不再出现。

5、缓冲盐

方法开发中有时会用到缓冲盐，如磷酸盐、醋酸盐等，有时参考的方法来源中，使用纯盐相和有机相进行梯度洗脱，刚开始色谱峰形及分离度良好，后来慢慢地发现保留时间、分离度等发生变化，且会出现明显的梯度峰，干扰检测；出现这种现象主要是因为日常使用维护不到位所致。

一般来说，纯盐的流动相最好不要超过2天，用不完配制新鲜的缓冲盐，尤其在夏季，微生物滋生较快，且在仪器运行过程中，seal wash一定要开启，否则泵头积累的盐会损坏泵头密封圈；色谱柱在使用后需要充分冲洗；纯盐管路用热水进行冲洗维护；若使用了长菌的流动相，色谱柱的柱效会急剧下降，很难再生恢复。

6、纯化水

纯化水在反相体系下使用较为频繁，水的质量非常关键，尤其是方法采用梯度洗脱且采集波长靠近末端，影响尤为明显。一般在方法转移时，可能会出现问题，若短时间内无法有效解决，可以尝试指定某个品牌的纯净水。

7、对照品

方法开发时，为了节约对照品，一般会先用原料药进行开发，做方法预验证，采用对照品进行确认，大多数情况下没有问题；但是对于一个多晶型的化合物而言，是需要关注的，因为对照品的合成路线及结晶工艺有可能和你的原料药不一致，导致在溶解对照品时产生差异，甚至无法溶解，这种情况需要重新采购别的品牌对照品或自己标定对照品。