通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经番红等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。
 

二、步骤
 

  革兰氏染色法的步骤为：涂片→固定→结晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脱色→番红复染→水洗→干燥→观察。

1、涂片 

  首先在载玻片上滴一小滴蒸馏水，用灼烧过的接种针挑取少量细菌，置于载玻片的水滴中与水混合并涂抹开。注意涂抹要均匀平坦，涂抹成直径约为1 cm的薄层。　

2、固定

  将载玻片在火焰上方快速来回通过一两次，以载玻片的加热面接触手背皮肤，不觉过烫为佳；待冷却后再在火焰上方来回通过一两次，再冷却，重复操作直到薄层变干。

3、结晶紫染色 

  染色1分钟，然后水洗并用吸水纸吸干。

  碘液媒染 染色1分钟，然后水洗并吸干。

4、酒精脱色

  用95%酒精脱色，直到酒精不出现紫色时即停止（大约半分钟），然后立即水洗，并吸干。

5、番红复染 

  染色3分钟左右，然后水洗并吸干。

6、镜检

  在显微镜油镜头下观察，菌体显蓝紫色的为革兰氏阳性菌；菌体显红色的为革兰氏阴性菌。
 

三、结果
 

  染色结果革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

四、意义

1、鉴别细菌 

2、选择药物 

3、与致病性有关

  革兰氏阳性菌能产生外毒素，革兰氏阴性菌能产生内毒素；而内毒素主要是指革兰氏阴性菌胞壁成分中的脂多糖，两者的致病作用不同。
 

五、注意事项
 

1、注意涂片不宜过厚，勿使细菌密集重叠，影响脱色效果，否则脱色不完全造成假阳性。镜检时应以视野内分散细胞的染色反应为标准。

2、火焰固定温度要适宜，以玻片不烫手为宜，否则菌体细胞变性。

3、滴加染色液与酒精时一定要覆盖整个菌膜，否则部分菌膜未受处理，亦可造成假象。

4、乙醇脱色是革兰氏操作的关键环节。如脱色过度，则G+被误染成G-菌，而脱色不足，G-被误染成G+菌。在染色方法正确无误的前提下，如菌龄过长、死亡或细胞壁受损伤的G+也会呈阴性反应，故革兰氏染色用要对数生长期的幼龄培养物。

5、染色过程的时间控制。应根据季节、气温调整。一般冬季时间可稍微长些，夏季可稍微短些。