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药物中芳香胺类基因毒杂质的检测方法与案例分享

嘉峪检测网 2019-11-08 17:50

正文：

概述

芳香胺类化合物（结构见图1）是医药工业中常用的原料，例如双氯芬酸钠的合成过程中使用了2,6-二氯苯胺作为起始原料、苯磺酸拉帕替尼的制备中以4-（3-氟苯甲氧基）-3-氯苯胺作为合成工艺的中间体，由于该类化合物结构中芳香烃的苯环与胺基的氮原子相连接，分子比较活跃，经代谢活化生成稳定的氮正离子（ArN⁺H），此离子能与DNA结合，具有致癌性和致突变性，特别是更易形成氮正离子结构的芳香胺的毒性更强。

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图1.芳香胺类化合物结构图

芳香胺类化物具有警示结构，是已知的潜在基因毒性杂质，其结构种类繁多，是基因毒性杂质中较为常见的一类。药品生产过程中是否有芳香胺类化合物的残留已成为现阶段药物研究过程中重要讨论和控制的内容，也已成为国内外药品注册审评不可缺少的项目，因此需要建立一种专属性强、灵敏度高的方法对该类杂质进行控制。

根据参考各国药典及文献，总结了部分含有芳香胺类化合物类基因毒杂质药物的种类，详见表1。

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表1. 含有芳香胺类化合物类基因毒杂质药物列表

常用的检测方法:

直接检测法：

目前芳香胺类化合物的检测方法较多，大多采用常规检测的方法，如GC 法、HPLC 法、GC-MS 法和LC-MS 法。据文献报道，有直接使用GC-MS的方法并采用多反应监测（MRM）扫描模式，直接测定吉非替尼原料药中3,4-二氯苯胺杂质的残留；利用LC-MS-MS的方法，在电喷雾离子化（ESI），正离子模式下MRM 采集，直接测定氟胞嘧啶中痕量基因毒性杂质N，N-二甲基苯胺的含量。值得注意的是，根据芳香胺的极性和弱碱性的差异，在利用GC 法进行检测时，可以使用不同的检测器以增加对特定胺的选择性，包括氮磷检测器、火焰光度检测器和电子捕获检测器等。

其他方法：

为了提高芳香胺类化合物的检测灵敏度，在检测前一般需进行样品预处理以分离富集痕量的芳香胺。有文献报道，利用阳离子交换柱的SPE技术对所检测的芳香胺进行富集，然后通过LC-MS的手段检测分析了22 种芳香胺的含量，SPE不仅能对芳香胺进行浓缩，还能消除基质残留对质谱离子化的不利影响，因此建立了一个高灵敏度和准确度的芳香胺的定量方法。还有采用SPME作为前处理方法，该方法作为无溶剂的萃取技术，与SPE技术相比更加简单快速。文献报道，以聚苯胺作为SPME的吸附涂层，并结合HS-GC-FID检测技术检测了6种芳香胺基因毒杂质，灵敏度为0.019~1.06μg/L。除此之外，芳香胺类化合物还能够经过衍生化处理后进行检测，该方法可以改善杂质与色谱柱相互作用而导致的峰形拖尾问题，同时还能提高检测的灵敏度。

案例

利伐沙班：

利伐沙班（Rivaroxaban，化合物1，图2），是口服直接Xa因子抑制剂，临床用于预防和治疗静脉血栓，预防髋关节或膝关节置换手术后的静脉血栓及预防非瓣膜性房颤的静脉血栓。在利伐沙班的合成工艺（图2）中，其中4-(4-氨基苯基)-3-吗啉酮为合成利伐沙班的中心前体，与化合物2-[(2S)- 2-环氧乙烷基甲基]-1异吲哚-1及3-(2H)-二酮和5-氯噻吩-2-碳酰氯为原料合成利伐沙班，4-(4-氨基苯基)-3-吗啉酮可能残留于利伐沙班形成杂质。4-(4-氨基苯基)-3-吗啉酮结构中含有基因毒性警示结构苯胺基团，具有潜在基因毒性，因此必须对其进行严格控制。基于TTC，以利伐沙班口服剂量10 mg/d计算，4- (4-氨基苯基)-3-吗啉酮的限度须不超过150 ppm。

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图2. 利伐沙班的合成工艺

因此，采用HPLC直接检测的方法测定4-(4-氨基苯基)-3-吗啉酮（化合物2）。根据ICH指南要求，对该方法进行了检测限、定量限、线性、精密度、准确性等相关验证，4-(4-氨基苯基)-3-吗啉酮在20.12-201.2ng/mL的范围内成良好的线性关系，相关系数r=0.9981，4-(4-氨基苯基)-3-吗啉酮的LOD和LOQ分别能够达到10.1ng/mL及30.3ng/mL，平均回收率为97.4%，本法灵敏、可靠、简便/操作简单且无机制干扰，适合在痕量水平下对利伐他班中基因毒杂质进行控制，为利伐沙班工艺过程控制和质量保障提供参考依据。

托拉塞米:

托拉塞米（Torasemide，化合物6，图3）是欧洲许多国家上市的一种新型降压利尿药，广泛用于治疗高血压、心力衰竭等各种浮肿性疾病。托拉塞米的合成工艺中以4-羟基吡啶为原料，加入浓硫酸反应得到中间体8，然后加入五氯化磷和三氯氧磷反应得到中间体9，用氨气饱和析出沉淀得到中间体10，再加入间甲苯胺（化合物11，图3）和异丙氨基甲酸甲酯为反应溶剂得到托拉塞米成品，该工艺所用的间甲苯胺含有遗传毒性致癌性杂质的警示结构，因此，依据EMA和FDA相应的指导原则，有必要对托拉塞米中的间苯甲胺的残留进行定量分析。根据ICH发布基因毒性杂质的最大摄取量为1.5 μg/d计算，卡维地洛最大日剂用量为100mg/d，则对应的基因毒性杂质间苯甲胺的TTC水平为15ppm。

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图3. 托拉塞米合成工艺

因此，采用LC-MS直接检测的方法对4-(2,3-环氧丙氧基)-9H-咔唑进行定量，在该方法下LOQ为2.68μg/g，LOD为0.825μg/g，在0.2~22.5μg/g的浓度范围内均成良好的线性关系，相关系数R²=0.9995，回收率为96.7-101.5%。该方法快速、简单、准确且经全面验证后符合检测的需求。

总结

芳香胺类化合物作为潜在的基因毒性杂质，通常作为起始物料、反应试剂或中间体存在于药物合成过程中，这些物料通常会作为杂质存在于终产品中，可能具有遗传毒性和致癌性而危害病人的健康。因此，药品中如果含有上述物质以基因毒性杂质的形式存在时，药品的质量就会存在潜在的风险，对人类健康造成威胁。由于芳香胺类化合物种类繁多，且化学性质各异，因此需从灵敏度、选择性、待测物稳定性、基质复杂性等进行全方面分析，选择合适的分析检测手段。

药品中基因毒性杂质研究的最大的挑战就是调节好基毒杂质的危害最小化和企业开发药品成本之间的平衡。基因毒性杂质研究需要更多的时间和资源，其研究内容包括控制策略及限度的设定、分析方法研究、验证以及放行检测，这些无疑将延迟药品申报及上市时间，同时增加药品的研发成本。因此，采用合适的手段来控制产品中的基因毒性杂质是非常必要的。EMEA和FDA指南以及ICH M7都明确要求充分评估基因毒性杂质的风险，控制原料药和药品中基因毒性杂质的残留限度。为了满足申报要求，建立科学的控制策略，使实际工艺中所有可能涉及的基因毒性杂质的风险得到明确鉴别和控制，以保证和提高药品的质量。

来源：Internet

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