1.概述

本文对单一小分子化合物（多组分化合物除外）的结构确证相关内容进行梳理概括。

2.小分子化合物进行结构确证的一般顺序

单一组分化合物通常是定向合成、天然产物提取、发酵提取或半制备等方式制备得到，通过液相或气相等检测手段评估纯度（原料药纯度通常≥99.0%；杂质纯度通常≥90.0%）后，主要通过核磁共振氢谱（1H-NMR）、光谱及常规质谱（MS）等方法，基于合成机理推断平面结构；如合成机理不明确，采用提取方式获得，或氢谱及质谱等常规方法对化合物结构判断的信息作用不大，则需要投入更多确证方法来辅助结构判断，如借助碳谱（13C-NMR），二维核磁等来确证；在解析得到平面结构后，如判断存在立体构型，应采用针对立体结构相应的研究手段，如NOESY、圆二色谱（CD）、单晶衍射等进行确证。

3.小分子化合物进行结构确证的研究手段

化合物结构初步确证后，按照相关指导原则，笔者根据化合物类别，对原料药（新化学实体、已知化合物）、起始物料/中间体/杂质（新化合物、已知化合物）结构确证的相关研究内容列表整理如下[1~3]。

表1 不同类别化合物的结构确证方法判断

4.结构确证经验总结

下文是笔者对曾用到的结构确证相关技术进行的简单阐述，因结构解析是一门系统的学科，内容较多且精深，在此不做具体结构解析的陈述。

4.1.高分辨质谱（HRMS）/质谱（MS）

与常规质谱相比，高分辨质谱（HRMS）测得化合物的分子量可精确至小数点后第四位，常用于辅助确定化合物的分子质量和和分子式，前提是通过核磁共振波谱已初步确定化合物结构。某些情况下，质谱可以起到结构确证的关键作用。

笔者曾解析一新化合物，在初步推断得到平面结构后，发现分子量与推断的结构不一致。仔细观察质谱发现，在分子离子峰右侧还有一M+2的离子峰（丰度比约3:1），才恍然醒悟分子结构中含有氯原子，新化合物结构得以破解。

卤素常有同位素峰，分子结构中存在的氯（Cl）和溴（Br）较典型，当分子中含有1个氯或溴时，相对丰度比分别为3:1或1:1；含有多个氯或溴时，笔者一般是手动计算，或采用Chemdraw中的Analysis m/z值来判断。

质谱解析中还有一条大家都比较熟悉的“氮规则”：化合物分子不含氮或含偶数个氮原子时，其分子离子的质量是偶数；化合物分子含奇数个氮原子时，其分子离子的质量是奇数。

4.2.元素分析

元素分析对化合物中的各元素进行含量测定，确定各元素的百分含量。

针对各元素的特点，元素分析可选择的方法较为多样。碳、氢、氮元素检测通常采用燃烧分解法；含卤素或硫的化合物，采用氧瓶燃烧-滴定法（中国药典2020年版四部通则0703）；金属元素可采用电感耦合等离子发射光谱法（ICP-OES）；磷元素可采用酸分解-比色法等。

测定完毕，比较测试结果与理论结果差值的大小，指导原则[1]规定“一般要求误差不超过0.3％”，在实际遇到的一些案例中，会存在样品容易吸潮或化合物含较多游离水，导致测试结果与理论结果误差超过0.3%。在元素分析解析时，建议元素百分含量测定值扣除化合物的水分测定结果后，再与理论值比较误差。

4.3.一维核磁共振波谱

取化合物2mg~10mg装入核磁管，用合适的氘代试剂进行溶解，用核磁共振波谱仪（频率通常400M~800M）进行检测，内标物为四甲基硅烷（TMS）。

1H的天然丰度较13C高很多，核磁测试时，两者频率通常是4倍关系，如氢谱（1H NMR）600M频率对应碳谱（13C NMR）150M频率；碳谱的响应较氢谱低，如果化合物量较少，在测试碳谱时，可通过积累扫描时长增加碳谱的响应；分子量大的化合物较分子量小的化合物检测用量要多。

氘代试剂的选择也非常关键，比较常见的氘代试剂有DMSO-d6，CDCl3，D2O，Methanol-d4，(CD3)2CO等。某些情况下，化合物的化学位移可能与氘代试剂（或氘代试剂中存在的水）在氢谱或碳谱中的化学位移重叠，影响结构确证，就需要更换氘代试剂进行测定。

指导原则[1]规定“对含有活泼氢的药物必需进行氘代实验，以提供活泼氢的存在以及位置的信息。”，选择氘代试剂时，可采用重水交换来确认活泼氢的存在。同时，可结合二维1H-1H COSY谱进行确认。

核磁出图后，研发人员常用MestRenova软件对图谱进行化学位移和积分处理，采用Chemdraw软件预测化合物的氢谱和碳谱数据，辅助判断平面结构。

如果化合物为已知化合物，通过与文献报道的氢谱（1H NMR）或碳谱（13C NMR）数据进行比对，则较易解析。

微谱数据库可进行检索查新，目前数据库中已收载137万多种化合物的碳谱数据，为植物化学或天然产物研发工作者提供了较大的便利。只需在微谱数据库中录入已获得的碳谱数据，则能很快获得文献已发表化合物和待解析化合物的相似度。该数据库需要收费[4]。

除了氢谱（1H NMR）和碳谱（13C NMR），DEPT（无畸变极化转移增强技术）和APT（碳连氢谱）也是一维核磁波谱。DEPT和APT谱用得较少，它们的作用是判断碳的类型。普通13C-NMR出的化学位移棒均是“朝上（正）”，DEPT和APT谱出的化学位移棒“有上（正）有下（负）”，常用135°DEPT。在135°DEPT实验中所有的季碳都不出峰，伯、叔碳为正（棒朝上），仲碳为负（棒朝下）。APT谱中季碳可以出峰，信号强度较DEPT谱增加。

4.4.二维核磁共振波谱

二维核磁共振波谱是对平面结构进行确证的关键。常用的为：HMBC（检出1H异核多键相干技术）、HSQC（检出1H异核单量子相干技术）、COSY（同核位移相关谱）、NOESY（核极化效应相关谱）。

HMBC对推断结构最为高效，它是看相隔2个或3个键氢原子与碳原子的远程相关性；COSY（通常是1H-1HCOSY）看相邻碳相连氢原子的相关性；HSQC看直接相连的碳氢相关性。通常通过这三种技术，即可初步确认化合物的平面结构。

JNP（Journalof Natural Products）杂志近期发表的某新的萜类化合物1的平面结构推断见图1，红色箭头表示的是根据HMBC谱推断的碳氢相关性，蓝色粗线表示的是1H-1H COSY谱推断的氢氢相关性。该化合物平面结构确证后，其相对构型通过NOESY谱进行确定，NOESY谱上可反映空间上的氢氢相关性，见图2，黑色箭头标出了空间氢原子相关。详细的解析过程和核磁共振图谱数据可查询参考文献[5]。

图1 新化合物1平面结构（红色箭头：HMBC；蓝色粗线：key COSY）

图2 新化合物1空间NOE相关性（黑色箭头：NOESY）

4.5.圆二色谱（CD）

圆二色谱（CD）是用于推断非对称分子的构型和构象的一种旋光光谱，可用于确证化合物的绝对构型。

上述新化合物1在通过二维核磁波谱确定了平面结构和相对构型后，通过圆二色谱计算结果与实验结果的拟合（见图3），最终确定了其绝对构型。

图3 新化合物1的圆二色谱及立体构型

4.6.单晶X-射线衍射（XRSD）

单晶X-射线衍射（XRSD）也是确定绝对构型的常用方法，可测定晶态分子的晶胞参数、晶系、空间群，可提供一个化合物在晶态中所具有原子的精确空间位置。该技术主要涉及单晶培养和检测。晶体培养难度较大，需不断尝试且有足够耐心。

剑桥晶体数据中心（CCDC, the Cambridge Crystallographic Data Centre）自1965年起就从事晶体数据的收集、整理与计算机化工作，该中心发展的剑桥结构数据库系统CSDS(CSDS，the Cambridge Structural Database System)是基于X光和中子衍射实验唯一的小分子及金属有机分子晶体的结构数据库（网址：https://www.ccdc.cam.ac.uk/structures/），其中收录了113万多化合物的晶体结构，每一个化合物均有自己的CCDC编号[6]。

图4是新化合物2的热椭圆形点图（ORTEP图）和CCDC数据库收录（CCDC编号：2048214）的3D动态模拟图截图[5]。

图4 新化合物2的ORTEP图及CCDC（编号：2048214）收录的3D动态模拟图截图

4.7.其他结构确证技术

除上述结构确证方法外，还有很多其他的结构确证技术，如红外、紫外、拉曼光谱、热重分析（TG）、差示扫描量热法（DSC）、旋光光谱等。

红外光谱、热重分析（TG）、差示扫描量热法（DSC）、偏光显微镜法等对化合物晶型的判断也可起到辅助作用。

某些化合物在固态时会表现出多晶型，多晶型会表现出红外光谱的差异；通常，结构中微小的差别会使红外光谱有很明显的差别[7]。老药组胺H2受体阻抗剂“西咪替丁”，参比制剂使用的原料药为A晶型，其原料药还存在另外三种晶型B、C、D，此外还有混合晶型。ABCD这四种晶型在红外光谱中的吸收存在微小差异（见下表），根据这些差异，可采用红外光谱来对A晶型产品进行鉴别[8]。此外，DSC也显示A晶型和B晶型在起始熔点和最高吸热峰存在差异，可用于晶型鉴别[9]。

表2 西咪替丁ABCD四种不同晶型的红外吸收峰

5.总结

本文对小分子化合物的结构确证方法进行了初步汇总，实际工作中，因化合物结构和性质差异，对结构确证技术方法的选择和应用应仔细剖析后使用。

参考资料：

[1]   化学药物原料药制备和结构确证研究技术指导原则（2005年）

[2]   手性药物质量控制研究技术指导原则（2006年）

[3]   新药 I 期临床试验申请技术指南（2018年）

[4]   微谱数据网（http://www.nmrdata.com/）

[5]   Terpenoids from the Marine-DerivedFungus Aspergillus sp. RR-YLW-12, Associated with the Red Alga Rhodomelaconfervoides [J]. Journal of NaturalProducts, 2021, 84, 6:1763-1771.

[6]   剑桥结构数据库系统CSDS（https://www.ccdc.cam.ac.uk/）

[7]   中国药典2020年版四部通则0400光谱法

[8]   Bela Hegedüs, Sándor Gorog. The polymorphismof cimetidine[J]. Journal of Pharmaceutical & Biomedical Analysis,1985, 3(4):303-313.

[9]   尹华, 杨腊虎, 等. 西咪替丁的晶型研究[J]. 药物分析杂志, 2001, 21(1):39-42.