一. 菌落总数所使用标准

 

食品企业一般会用到的两个做菌落总数的标准（当然还有其他标准）：

 

食品国家标准：

 

GB 4789.2-2016 《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》

 

生产用水：

 

GB/T 5750.12-2006 《生活饮用水标准检验方法 微生物指标》

 

以这两个标准来说，它们的检测方法是差不多，主要区别在于培养基的不同和样品的状态不同（食品中有固态和液态，生活饮用水只有液态）。食品的培养基是使用PCA，生产用水的使用NA。

 

二. 培养基成分

 

1. PCA（平板计数琼脂培养基）

 

胰蛋白胨       5.0g

 

酵母浸膏       2.5g

 

葡萄糖          1.0g

 

琼脂           15.0g

 

蒸馏水     1000mL

 

注：胰蛋白胨提供碳源和氮源；酵母浸粉提供B族维生素；葡萄糖提供能源；琼脂是培养基的凝固剂。

 

2. NA（营养琼脂）

 

蛋白胨        10g

 

牛肉膏        3g

 

氯化钠        5g

 

琼脂          14g（标准10g-20g）

 

蒸馏水        1000mL

 

注：蛋白胨和牛肉膏粉提供氮源、维生素、氨基酸和碳源;氯化钠能维持均衡的渗透压;琼脂是培养基的凝固剂。

 

三. 检测方法

 

 

四. 操作注意细节

 

1. 菌落总数是比较常规的微生物检测项目，也是比较容易做的一个微生物检测方法，主要注意无菌操作，与稀释液均匀性。

 

2. 在空白出现菌落的时候需要去分析哪一步出现问题，人机料法环。当然空白出现菌落的时候，那么该批次的菌落总数数据都作废处理。在制样和做样的时候需要在百级的环境（百级的洁净工作台）下进行。

 

3. 稀释液的均匀性，这个会影响结果，刚开始的时候可能会造成同一梯度的两个结果相差有点远，这个是因为做的时候没有把稀释液均匀。如果前后两个梯度没有梯度性，那么就是在做稀释做不好。这个都是靠多做，技术才会提高。（当然还有一种情况，样品是中添加了抑菌物质，这样没有梯度性。）

 

五. 计数

 

1. 可用肉眼观察，必要时用放大镜或菌落计数器，记录稀释倍数和相应的菌落数量。菌落计数以菌落形成单位(colony-formingunits , CFU )表示。

 

2. 选取菌落数在 30CFU~300CFU 之间、无蔓延菌落生长的平板计数菌落总数。低于 30CFU的平板记录具体菌落数，大于 300CFU 的可记录为多不可计。每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。

 

3. 其中一个平板有较大片状菌落生长时，则不宜采用，而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释度的菌落数；若片状菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均匀，即可计算半个平板后乘以2，代表一个平板菌落数。（这个是很多新手会问的一个问题）

 

4. 当平板上出现菌落间无明显界线的链状生长时，则将每条单链作为一个菌落计数。

 

6. 若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每 g ( mL )样品中菌落总数结果。

 

7. 若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按式( 1 )计算:

 

 

8. 若所有稀释度的平板上菌落数均大于 300CFU，则对稀释度最高的平板进行计数，其他平板可记录为多不可计，结果按平均菌落数乘以最高稀释倍数计算。

 

9. 若所有稀释度的平板菌落数均小于 30CFU，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

 

10. 若所有稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长，则以小于 1 乘以最低稀释倍数计算。

 

11. 若所有稀释度的平板菌落数均不在 30CFU~300CFU 之间，其中一部分小于 30CFU 或大于300CFU 时，则以最接近 30CFU 或 300CFU 的平均菌落数乘以稀释倍数计算。

 

六. 菌落总数的问题

 

1. 有新人可能会拿着菌落总数的平板去问别人这是什么菌？

 

答：这是看不出来的，菌落总数只能检测出样品卫生情况，一个样品的细菌数量，不能验证出什么菌。这是一个不应该犯的误区。

 

2. 若所有稀释度的平板菌落数均不在30CFU~300CFU之间,其中一部分小于30CFU或大于300CFU 时。就会有人不知道怎么去判定那个梯度更接近30-300。

 

举例：一个梯度：28/28；另梯度：305/305，那么那个数据更接近呢？

 

两个方法（网友提供）：

 

①按标准字面意思直接做差比较后再乘以稀释倍数：28-30=-2，他们相差2；305-300=5，他们相差5。2比5要小，那么采取28相应的梯度再乘以稀释倍数；

 

②恢复为同稀释度做差比较：把两个梯度换算成同一个梯度，一般把28换算成280。280-300=-20，相差20；305-300=5，相差5。20比5要大，那么采取305相应的梯度。

 

（个人意见：我是更偏向于第二种，因为要在同一个梯度上做比较才能体现出数据的可靠性，同时我偏向采用前一个梯度的数字，那么这个数值可以减少一步步骤带来的误差，数据可能更加接近样品的情况）

 

3. 有时候会出现这么一个情况，最低稀释梯度中一个平板出现1个菌落，另一个无菌落生长。那么结果怎么出呢？

 

答：（以固态为例子）在过去也有讨论过，有人认为报告写5，也有认为报告写＜10（比较两个平板均无菌落生长的时候报＜10）这个两个报告方法其实也是可以采用。（我是采用第一种；个人理解不长报告＜10，那么长了也报＜10吗？不太合理）

 

4. 在做菌落总数的时候，有时候会样品和菌落分不清的（老前辈不会这样），那么如何区分两种物质呢？

 

答：在培养基中添加TTC（一般2%浓度1mL加到400mL的培养基中，TTC的浓度不要过高，会有抑制作用）。TTC的原理：TTC和活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶反应，生成红色的甲月赞。那么生长的菌落会变成红色，这样就可以区分菌落与样品。

 

还有一个方法：4℃冷藏保存一个样品和培养基混匀的平板做对照，观察菌落的形态特征，老前辈们基本靠这个去区分的。

 

5. 菌落总数计数包括霉菌吗？

 

答：菌落总数的概念是这么规定的，食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度、培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。所以也包括在PCA上生长的霉菌和酵母等微生物。

 

6. 培养基温度不好控制？

 

答：前提是培养基灭菌好了放在水浴锅内保温46摄氏度。使用时一个同事在外面把培养基从水浴锅拿到传递窗，培养基表面喷酒精杀菌，然后开启传递窗的紫外灯5min（这一步是对培养基表面杀菌，减少对洁净房的污染）。里面的同事5min之后拿起来放在手心人体不觉烫手，这样的温度最佳倒平板。（注意：倒平板的速度要快，一次最好只拿一瓶，避免培养基凝固）

 

7. 有些朋友不理解菌落总数的单位CFU的意思。

 

答：CFU为Colony-Forming Units英文缩写，其含义是形成菌落的菌落个数，不等于细菌个数。（比如两个相同的细菌靠得很近或贴在一起，那么经过培养这两个细菌将会形成一个菌落，此时就是2个细菌，1CFU）。菌落总数往往采用的是平板计数法，经过培养后我们数出平板上所生长出的菌落个数，从而计算出每毫升或每克待检样品中可以培养出多少个菌落，于是以CFU/mL或CFU/g报告之。

 

8. 菌落超标的危害。

 

答：食品的菌落总数严重超标，说明其产品的卫生状况达不到基本的卫生要求，将会破坏食品的营养成分，加速食品的腐败变质，使食品失去食用价值。消费者食用微生物超标严重的食品，很容易患痢疾等肠道疾病，可能引起呕吐、腹泻等症状，危害人体健康安全。

 

但需要强调的是，菌落总数和致病菌有本质区别，菌落总数包括致病菌和有益菌，对人体有损害的主要是其中的致病菌，这些病菌会破坏肠道里正常的菌落环境，一部分可能在肠道被杀灭，一部分会留在身体里引起腹泻、损伤肝脏等身体器官，而有益菌包括酸奶中常被提起的乳酸菌等。但菌落总数超标也意味着致病菌超标的机会增大，增加危害人体健康的几率。

 

9. 培养后的培养基出现干裂情况。

 

答：干裂是由于培养基里面的水份缺失导致，所以当出现干裂情况，先要观察干裂平板的数量和位置。看是否是培养箱内部温度不稳定导致（一般平皿一叠可以放置六个，同时要注意每叠之间需要保留一点间隙让其通风）；排除仪器的原因之后，看是培养基否倒得太薄（初学者可以拿三角瓶装水进行练习）；还有其他原因，其实在出现干裂的情况下，结果是无效的（除非干裂情况不严重）。排查出问题所在，可以避免我们下次再犯错。

 

10. 培养基的配置。

 

答：培养基的包装上（标准上）都会写着先煮热溶解再分装，那么是不是一定要煮热溶解呢？首先瓶子上的配置方法是直接配置一升的PCA，这里是必须要煮热溶解（防止不均匀，使得部分培养基不凝固）。

 

其实配置培养基有两个方法：第一个：用一个大容器配置培养基，然后加水煮热溶解（注意搅拌，防止烧焦），待溶解完成之后进行分装（这里需要注意安全），再去灭菌。第二个方法就是使用500mL三角瓶（其他容器也可以）配置300mL的培养基，加水稍微溶解（此步不需要加热），再拿去灭菌。