刚刚，国家药品监督管理局医疗器械技术审评中心发布《I型胶原软骨修复产品注册审查指导原则（征求意见稿）》，内容如下：
（征求意见稿）
本指导原则旨在指导注册申请人对I型胶原软骨修复产品注册申报资料的准备及撰写，同时也为技术审评部门对注册申报资料的审评提供参考。
本指导原则是对I型胶原软骨修复产品注册申报资料的一般要求，申请人需依据产品的具体特性确定其中内容是否适用。若不适用，需具体阐述理由及相应的科学依据，并依据产品的具体特性对注册申报资料的内容进行充实和细化。
本指导原则是供注册申请人和技术审评人员使用的指导性文件，但不包括审评审批所涉及的行政事项，亦不作为法规强制执行，需在遵循相关法规的前提下使用本指导原则。如果有能够满足相关法规要求的其他方法，也可以采用，但是需要提供详细的研究资料和验证资料。
本指导原则是在现行法规和标准体系以及当前认知水平下制定的，随着法规和标准的不断完善，以及科学技术的不断发展，本指导原则相关内容也将进行适时的调整。
一、适用范围
根据产品的形式，I型胶原软骨修复产品主要分为两大类：I型胶原软骨修复凝胶，具有微观网络结构；I型胶原软骨修复固体支架（包括海绵状或膜片状），可为单层或多层。本指导原则适用于I型胶原软骨修复凝胶类产品。
本指导原则所涉及的I型胶原软骨修复凝胶类产品，是指所用原材料限定于由动物（牛、猪、鼠、鱼等）的组织（皮肤、肌腱、骨骼等）提取、分离及纯化（交联或非交联）得到的I型或I/III型胶原蛋白，可采用不同的物理、化学交联方法及其它工艺制备而成的凝胶状支架产品。
该指导原则不适用于重组胶原蛋白制成的产品，也不包括含细胞（如软骨细胞、间充质干细胞）、生物因子（如干细胞生长因子、骨形态发生蛋白）等的产品，亦不包括预期与细胞或生物活性因子组合使用的产品。相关药械组合产品应遵循其它相关标准或指导原则等的要求，复合其他材料制备的特殊设计及创新设计的软骨修复产品可参考本指导原则中适用的部分。
二、注册审查要点
（一）监管信息
1.产品名称
产品的命名需采用《医疗器械分类目录》或国家标准、行业标准中的通用名称，或以产品临床预期用途、固化方式、适用部位为依据命名，需符合《医疗器械通用名称命名规则》等相关法规的要求。
2.分类编码
根据《医疗器械分类目录》，分类编码为13-10，管理类别为III类。
（二）综述资料
1.产品描述
需全面描述产品I型胶原蛋白及其它成分的含量、纯度及来源，产品结构形式（结构示意图和/或实物图）、主要成型工艺、工作原理、交付状态、灭菌方式及货架有效期等，以及区别于其他同类产品的特征等。
2.作用机理
需描述产品的作用机理，建议提供产品的操作步骤说明及图示。
3.适用范围和禁忌证
产品的适用范围、适用人群、禁忌证需与申报产品的性能和功能相符。
3.1适用范围
I型胶原软骨修复产品一般用于限定面积的软骨缺损的修复，需明确预期手术术式、植入部位及与其组合使用的其它器械和医疗产品。
3.2预期使用环境
明确预期使用的地点（如医疗机构的条件），说明可能影响其安全性和有效性的环境条件。
3.3适用人群
明确目标患者人群信息、患者选择标准信息以及明确使用过程中需要考虑的因素。
3.4禁忌证
如适用，通过风险/受益评估后，针对某些疾病、情况或特定的人群，认为不推荐使用该产品，应当明确说明，如对产品材料成分过敏的人群。
4.产品型号规格
提供产品各型号规格的划分原则。对于存在多种型号、规格的产品，需明确各型号、规格的区别，采用对比表及带有说明性文字的图片、图表，对各种型号、规格的结构组成、功能、产品特征、性能指标等方面加以描述。需提供体现产品设计特征的关键信息，如成分配比、体积或重量、产品装量等。
5.与同类产品或前代产品的比较信息
应当提供同类产品（国内外已上市）或前代产品（如有）的信息，阐述申请注册产品的研发背景和目的。对于同类产品，应当说明选择其作为研发参考的原因。
申请人需综述同类产品国内外研究及临床使用现状及发展趋势，同时列表比较说明申报产品与参考产品（同类产品或前代产品）在材料工作原理、结构组成、制造材料、性能指标、适用范围、作用方式、应用技术等方面的异同。明确产品有无使用新材料、新的活性成分、新技术、新设计或具有新作用机理和新功能。
6.包装说明
提供产品的包装信息，包括包装形式、包装材料、包装工艺。对于具有微生物限度要求的医疗器械，应当说明保持其微生物限度的包装信息。说明如何确保最终使用者可清晰地辨识包装的完整性。
（三）非临床资料
1.产品风险管理资料
注册申请人需对产品全生命周期实施风险管理，提交风险管理资料（参照GB/T 42062《医疗器械 风险管理对医疗器械的应用》），充分识别产品的设计、原材料、制造过程、产品包装、灭菌、运输、贮存、使用等产品生命周期内各个环节的安全特征，从生物学危险（源）、环境危险（源）等方面，对产品进行全面的风险分析，并详述所采取的风险控制措施。
风险管理报告需包括生产和生产后信息，具体内容参考GB/T 42062第9章和《医疗器械安全和性能的基本原则》的2.1.2e)f)。产品变更注册和已在境外上市产品注册时，申报资料中的风险管理报告需包括上述内容，将风险管理贯穿于产品的全生命周期。
2.医疗器械安全和性能基本原则清单
说明产品符合《医疗器械安全和性能基本原则清单》各项适用要求所采用的方法，以及证明其符合性的文件。
3.产品技术要求的主要性能指标
产品技术要求需符合相关国家标准、行业标准和有关法律、法规的相应要求。在此基础上，注册申请人需根据产品的特点，制定确保产品安全、有效的技术要求。产品技术要求中试验方法需依据有关国家标准、行业标准、国际标准制订，或经过充分的验证。
3.1产品型号/规格及其划分的说明
列表说明产品的型号、规格，明确产品型号、规格的划分说明，明示产品组成及结构。推荐采用图示和/或表格的方式。
3.2性能指标
根据产品特性，选择适用的项目进行规定，例如外观（如性状、颜色）、可见异物、装量、胶原蛋白含量、复合成分含量（若适用）、总糖含量、脂肪含量、伴生的其他类型胶原、杂蛋白分析、水分、酸碱度、炽灼残渣、酸水解产物、色氨酸检查（去端肽时）、重金属总量和微量元素、添加剂（包括溶剂）残留、交联剂残留（若适用）、无菌性、环氧乙烷残留（若适用）、细菌内毒素等。
3.3检验方法
产品的检验方法需根据技术性能指标设定，检验方法需优先采用公认的或已颁布的标准检验方法（可参考本指导原则参考文献中引用的相关标准）；自建检验方法需提供相应的方法学依据及理论基础，同时保证检验方法具有可操作性和可重现性，必要时可附相应图示进行说明，文本较大的可以附录形式提供。
3.4附录
产品材料的理化性能特征，以资料性附录形式体现。对于胶原材料，一般需考虑熔点、胶原蛋白分子量（含动力黏度）、胶原蛋白纯度、肽图，同时建议考虑胶原蛋白高级结构分析、胶原蛋白自组装性能、热稳定性、胶原蛋白-细胞相互作用等。
4.研究资料
注册申请人需提供产品技术要求的研究和编制说明，包括功能性、安全性指标的确定依据，所采用的标准或方法、采用的原因及理论基础。需提供产品材料和产品设计相关理化及生物性能的研究资料，并提供其可接受的依据，必要时，与已上市同类产品相关性能进行对比，以证明其安全有效性。研究资料选择适用的项目进行研究验证，主要包括但不限于如下研究项目：
4.1化学/材料表征研究
4.1.1胶原蛋白材料表征
需明确产品I型胶原的具体来源及其制备工艺。胶原蛋白材料的表征至少需包括如下项目：
4.1.1.1 I型胶原蛋白分子量
按照YY/T 1805.2《组织工程医疗器械产品 胶原蛋白 第2部分 I型胶原蛋白分子量检测十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法》 进行测试。
4.1.1.2 I型胶原蛋白纯度
胶原蛋白具有其他蛋白所没有的三股螺旋结构，可以在特异性的胶原蛋白酶作用下水解形成小分子多肽或者氨基酸；而非胶原蛋白却不会受到胶原蛋白酶的水解作用。因此，可以利用胶原蛋白酶水解样品，结合考马斯亮蓝对牛血清白蛋白（BSA）染色极限的确定，检测胶原蛋白样品中所含杂蛋白总量，进而通过相应计算得到胶原蛋白纯度。
具体方法参照YY/T 1453《组织工程医疗器械产品 I型胶原蛋白表征方法》中的规定进行。
4.1.1.3 肽图
参照YY/T 1453《组织工程医疗器械产品 I型胶原蛋白表征方法》中规定方法测试。即，将样品进行热变性后，通过胰蛋白酶使变性胶原降解；然后按照《中华人民共和国药典》四部3405肽图检查法第一法规定的方法进行。
4.1.1.4其它
随着相关行业标准的更新，需进一步开展胶原蛋白高级结构分析、胶原蛋白自组装性能、热稳定性、胶原蛋白-细胞相互作用等研究。
4.1.2产品组成成分表征
4.1.2.1 I型胶原蛋白鉴别
参照YY/T 1453《组织工程医疗器械产品 I型胶原蛋白表征方法》规定方法进行测试。即，按照《中华人民共和国药典》四部0541电泳法第四法规定的方法进行，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法，分离胶浓度为7%，加样量应不低于20μg，比较样品、I型胶原蛋白对照品经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析后的谱带。样品与I型胶原蛋白对照品电泳条带应一致。
4.1.2.2胶原蛋白含量
参照YY/T 1453《组织工程医疗器械产品 I型胶原蛋白表征方法》中规定方法测试。I型胶原蛋白原料经干燥恒重后，精密量取供试品（约相当于含氮量1.0mg～2.0mg），按照《中华人名共和国药典》四部0731蛋白质含量测定法第一法规定进行，得到样品中总蛋白含量，结果以干重计。
胶原蛋白含量（%）= 样品中总蛋白含量（%）× 纯度
4.1.2.3 总糖含量
参照YY/T 1453《组织工程医疗器械产品 I型胶原蛋白表征方法》中规定方法测试，以D-无水葡萄糖为对照，精确量取空白组（HCl 0.01mol/L）、对照组系列溶液（含D-无水葡萄糖20-100ug）、供试品溶液（含胶原2～20mg，HCl 0.01mol/L）各2ml，精确加入5%苯酚溶液1mL，然后迅速加入浓硫酸5.0mL，摇匀，40℃水浴保持40min，取出后迅速放入冰水中冷却20min。利用样品中多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，在波长490nm处进行比色测定。然后通过对照品吸光度-浓度回归方程，计算出样品中相当于以D-无水葡萄糖的质量。
4.1.2.4脂肪含量
参照YY/T 1453中规定方法测试。即，称取干燥恒重的样品3g-5g（约含脂肪20mg-100mg），移入到250mL烧瓶中，加入约100mg焦性没食子酸和十一碳酸甘油三脂内标溶液2mL，加入几粒沸石，再加入2mL 95%乙醇，混匀。然后加入8.3mol/L盐酸溶液10mL，混匀。将烧瓶放入70℃-80℃水浴中水解40min。每隔10min震荡下烧瓶，使粘附在烧瓶上的颗粒物混入溶液中。水解完成后，取出烧瓶冷却至室温。最后加入10mL乙醇混匀。按照GB/T 22223的方法对样品中的总脂肪含量进行测定，结果以样品干重计。
4.1.2.5伴生的其他类型胶原
与I型胶原伴生的III型胶原、V型胶原，对I型胶原自组装有影响，应评估和控制其在终产品中的含量，以确保产品批次间的一致性。其中，III型胶原作为I型胶原主要的伴生胶原，可以采用天狼猩红染色或者更精确的免疫组化、免疫荧光、ELISA等技术对I型和III型胶原进行鉴别与量化。
天狼猩红染色法鉴别I型胶原与III型胶原的原理是：由于天狼猩红是一种强酸性阴离子染料，可与呈碱性的胶原反应，使胶原纤维在偏振光照射时，产生明显的双折光现象。不同的胶原纤维具有不同的旋光性，在偏振光显微镜下呈现相异的颜色，借以区分I、II、III和IV型胶原。其中，I型纤维紧密排列，显示很强的双折光性，呈黄色或红色的纤维；II型纤维显示弱的双折光，呈多种色彩的疏松网状分布；III型纤维显示弱的双折光，呈绿色的细纤维；IV型纤维显示弱的双折光的基膜，呈淡黄色。因此，可以通过天狼猩红染色对I型胶原和III型胶原进行鉴别与量化。
天狼猩红染色法：I型胶原溶液经冷冻干燥后，通过常规石蜡包埋、切片（约5μm）、脱蜡至水，然后切片在1g/L的天狼猩红溶液中染色1h。染色后切片经过常规脱水透明后，用中性树脂封固，室温放置干燥。干燥后的切片在偏光纤维镜下观察拍照，并通过图像分析软件对两种颜色的胶原纤维面积进行分析，得到不同类型胶原的含量。
4.1.2.6重金属总量和微量元素
其中，重金属总量以Pb计。取胶原炽灼残渣下遗留的残渣，按照《中华人民共和国药典》0821重金属检查法第二法进行。
微量元素参照YY/T 1453《组织工程医疗器械产品 I型胶原蛋白表征方法》中规定方法测试。即，精密称取样品，经硝酸消化，制成供试品溶液，通过原子吸收分光光度计测定铬、镉、铜、铁、镍、铅、钼的含量，用原子荧光光谱仪分析法测定砷和汞的含量。
4.1.2.7有毒物残留
I型胶原提取制备过程中，可能存在有毒成分如三氯甲烷、过氧乙酸等残留。参照《中华人民共和国药典》相应检测方法进行测试。
4.1.2.8酸碱度
酸碱度（pH值）是影响胶原分子发生自组装的关键条件，pH为7.0-7.5 的胶原溶液可以顺利的形成凝胶且成胶时间和成胶效果不会受到明显的影响。按照《中国药典》 四部通则0631的pH值测定法，取胶原凝胶前驱体溶液，采用酸度计测定pH值。
4.1.2.9外源性DNA残留
按照《中华人民共和国药典》四部3407外源性DNA残留量测定法“荧光染色法”或“定量PCR法”进行。或者参照YY/T 1876《组织工程医疗产品 动物源性生物材料DNA残留量测定法：荧光染色法》中规定方法测试。
4.1.2.10 α-Gal残留
α-半乳糖基抗原（简称 Gal 抗原）是动物组织、器官移植到人体引起超急性免疫排斥反应的主要靶抗原，广泛存在于牛、猪和其他低等动物体内，人体由于有 2 个碱基错位变异而不表达 Gal 抗原，但人血清中存在高滴度的抗-Gal 抗体，因此当人体接受含有 Gal 抗原的组织或生物材料时就会引起补体介导的抗体依赖型细胞毒性效应，引起免疫排斥及免疫毒理反应。Gal 抗原缺失小鼠已被广泛应用于异种免疫原性评价。参照YY/T 1561《组织工程医疗器械产品 动物源性支架材料残留α-Gal》中规定方法进行测试。
4.1.2.11 EO残留
对于经环氧乙烷灭菌后产品的EO残留量的可耐受接触限量，建议参考GB/T 16886.7《医疗器械生物学评价 第7部分：环氧乙烷残留量》中4.3.5.2的要求进行规定。
4.1.2.12复合组分分布
对于含复合材料（如缓冲液、中和成分等）的产品，需通过红外光谱、拉曼光谱、X射线能谱等方法对原材料中复合组分的分布进行研究。
4.2物理和机械性能研究
4.2.1凝胶化性能和可注射性
凝胶化性能对原位注射赋型的胶原水凝胶非常重要，可以通过倾斜法、浊度法、光散射法以及动态流变仪等检测手段表征胶原分子聚合动力学、聚合能力、凝胶化时间等。
4.2.1.1凝胶化性能
倾斜法：将调整到中性的胶原溶液装入玻璃试剂瓶中，间隔固定时间倒置观察玻璃瓶中溶液流动情况，当倒置后溶液不流动则表明胶原溶液已固化交联，此时的时间定义为凝胶化时间。
流变学测试：将调整到中性的胶原溶液滴加在流变仪测试台上，在固定剪切频率0.1 rad/s和固定形变0.1%下，测试样品储能模量(G’)和损耗模量(G’’)随时间的变化曲线，初始时储能模量低于损耗模量，一定时间后，储能模量等于损耗模量，该时间点定义为成胶时间。
水凝胶交联度在很大程度上影响着物理性能，实际交联程度与理论交联程度的比值可直接反映交联度。在某些情况下，可简单地通过计算成胶后浸出物的比例来反映水凝胶交联程度。
4.2.1.2可注射性
主要通过测量剪切粘度来予以判定。
剪切变稀表征：以流变仪和固定形变（0.1%），进行剪切应力扫描或剪切频率扫描，测试随剪切应力或剪切速率增加水凝胶样品的粘度变化。
宏观可注射性：通过压缩实验检测推动注射器所需力大小，考察不同条件下（储存时间、注射浓度、温度、针头大小等）其可注射性能。
4.2.2水性环境下的形态稳定性
4.2.2.1溶胀或收缩性能
正常软骨的含水率约为70%（65%-80%），并因此维持着良好的营养物质透过性能。高的含水率有利于支架材料相关营养物质的渗透运输。通过测定材料浸泡前后的质量或者体积变化对材料的溶胀速率、或收缩性能进行表征。
将固定尺寸的水凝胶样品称重并记录体积，然后将样品浸泡于pH 7.4的PBS缓冲液中，置于37℃恒温摇床中，放置固定时间，取出水凝胶材料，用滤纸擦掉材料表面多余水分，进行称重并测定样品体积。分别计算溶胀和收缩情况下样品质量和体积变化率。
4.2.2.2保水性
制备好的水凝胶放置在舒适的自然条件下，记录温湿度变化。在一段时间内测定凝胶的质量变化，用质量百分数表示。前后质量差与初始质量之比定义为质量变化百分比。
4.2.3体外力学性能
机械性能或者粘弹性在影响细胞行为与细胞诱导的基质重塑中具有重要作用，根据材料的形态与大小选择，通过流变仪、动态力学分析仪（DMA）、纳米压痕仪（Nano-indenter）等对胶原水凝胶力学性能(压缩、剪切等模式)与粘弹性（蠕变、应力松弛、动态力学）进行测试。需注意材料模量等与组织的匹配度及体内生物力学微环境影响下的稳定性。
4.2.3.1弹性模量
以DMA对样品进行压缩测试，分析其压缩曲线，在低形变线性弹性区（一般0 -15%）计算样品的弹性模量。
4.2.3.2蠕变和应力松弛
在应力松弛表征时，固定材料形变，观察应力随时间的变化趋势；在蠕变行为表征时，固定施加在材料上的初始应力，观察形变随时间的变化趋势。
4.2.3.3体外抗疲劳性能
对于承重部位的软骨，在人的日常活动中要经历反复的挤压，因此对于胶原水凝胶软骨修复材料的抗疲劳力学性能也提出了相应的要求，可采用液体浸没式材料动态力学性能测试仪（DMA）等仪器对水凝胶的抗疲劳性能进行考察。
循环压缩强度：通过压缩加载-卸载循环研究水凝胶的能量耗散。胶原水凝胶样品被压缩到一定应变（一般0-30%）下循环10次。需根据应力应变定义出能量耗散方程。
通过两种加载方法测试材料的抗疲劳性能：第一种为线性循环加载，使用DMA测试，以恒定加载速率加载至固定压力，然后以相同速率卸载，循环一定次数，获得应力-应变曲线；第二种为循环加载卸载，使用DMA进行测试，以恒定的加载压力和加载-卸载频率，循环一定次数，获得形变随时间变化的曲线。
4.2.4微观结构
胶原水凝胶的纤维网络结构模拟了细胞外基质（ECM）的微观结构，影响细胞的粘附、铺展和分化。可将水凝胶样品经液氮处理后冻干，通过扫描电子显微镜(SEM)观察纤维形态、直径、分布以及多孔结构。拍摄后的图像可采用Image J等图像处理软件对其进行处理和数据收集，而后进行统计计算，但冻干过程引起了凝胶网络结构改变，故仅作为间接评价方法。或者，水凝胶样品直接采用低温扫描电子显微镜(cryo-SEM)或环境扫描电子显微镜对样品的孔结构、纤维形态等进行表征。
4.2.5传质性能
物质传递性能指细胞、营养、废物物质向基质中或者在基质中扩散的能力，可通过荧光染料-共聚焦显微镜、扩散室、光密度分析等表征。材料需有利于细胞黏附、迁移和增殖；有利于氧气和营养物质传输；有利于代谢物的排出和组织的长入。
为检测胶原水凝胶营养物质的透过性能，可采用氯化钠作为营养物质中离子性物质的代表，色氨酸作为小分子营养物质的代表，测定氯化钠和色氨酸的透过率；同时，可通过共聚焦显微镜观察荧光蛋白分子的扩散来表征水凝胶对蛋白分子的透过率。
4.3生物学特性研究
4.3.1生物相容性评价资料
生物相容性评价应遵循GB/T 16886.1《医疗器械生物学评价第1部分：风险管理过程中的评价与试验》相关要求，生物相容性评价资料可以参考《医疗器械生物学评价指南》，结合产品的预期接触部位和累积使用的接触时间，必要时开展生物学试验。生物学风险评价终点一般包括细胞毒性、致敏、刺激或皮内反应、材料介导的致热性、急性全身毒性、亚急性毒性、慢性毒性、亚慢性毒性、植入反应、遗传毒性和致癌性。需结合物理和/或化学表征、降解性能等论证产品在上述各项生物学风险评定终点的安全性。
4.3.2生物学性能
对产品与软骨修复相关的生物学性能进行评价，一般可开展产品对细胞的粘附、迁移、增殖、分化等影响的生物学性能评价试验。I型胶原软骨修复产品（支架或凝胶）在植入软骨缺损部位后，通过宿主细胞（骨髓间充质干细胞、滑膜来源干细胞、周围软骨细胞）的迁移长入、增殖、分泌细胞外基质，预期将形成透明软骨组织/纤维软骨组织，实现对软骨病损部位的修复再生。这个修复再生过程可能会长达6个月至1年，在这个过程中，患者被动/主动的活动对植入部位施加的力学载荷也可能与产品的修复再生效果相关。
在拟进行体外模拟研究而设定体外试验参数时，宜充分考虑与产品修复再生关节软骨相关的体内因素，如细胞类型、细胞数量、力学刺激等。用作体外研究的产品样品宜具有代表性，需注意样品尺寸（厚度）与全型产品不同对体外试验结果的影响。体外细胞试验宜选择预期体内发挥修复再生作用的主要细胞类型，细胞接种方式、细胞接种数量要能与植入后初期/早期能长入/迁移入产品的方式和细胞数量相适宜。需要对采用的细胞培养条件提供合理化理由，例如考虑体内软骨修复时的体液环境/软骨的营养方式等，可考虑采用无血清培养基或低百分比含量血清的培养基、低氧培养条件等。体外细胞试验也可考虑施加力学刺激，例如静水压。
在体外细胞试验环节，需对与I型胶原软骨修复产品软骨修复相关的生物学性能建立半定量/定量的指标和检测方法。例如，如考虑I型胶原软骨修复产品支持软骨相关细胞的增殖、迁移和/或细胞外基质的分泌等，这些性能与软骨修复相关，则宜建立相应的检测细胞增殖、迁移和/或细胞外基质分泌等试验方法，通过对多批次产品的检验/工艺研究，获得相关的试验数据。由于体外细胞试验的特性和局限性，在研发/工艺研究过程中，需要通过动物试验、临床试验结果来验证这些预期生物学性能的相关性。推荐在这样的体外试验/细胞试验、体内动物试验/临床试验环节中，确定I型胶原软骨修复产品与其软骨修复间具有因果关系的生物学性能。并且，由于体内动物试验费时和不易进行，推荐建立体外生物学/细胞试验的定量检测方法，对与产品软骨修复具有因果关系的生物学性能进行表征，从而可作为不同批次间I型胶原软骨修复产品的关键质量控制指标之一。从另一方面考虑，这也是由于I型胶原软骨修复产品材料特性影响因素众多并且特性复杂，例如提取的I型胶原受动物来源、提取工艺的影响，I型胶原具有复杂的蛋白质组成和结构，制成支架材料后又增加了与支架材料相关的特性，目前有关I型胶原蛋白或支架的某项/某些材料特性与软骨修复性能因果关系的直接证据不足，一般认为通过某项/某些材料特性的表征不能直接预示体内修复效果。因此，宜在I型胶原材料特性表征的基础上，建立对I型胶原生物学特性的体外生物学/细胞试验的定量检测方法，达成对I型胶原软骨修复产品的关键质量控制。
4.3.3生物安全性评价资料
可参照《动物源性医疗器械注册技术审查指导原则》的要求提供产品免疫原性评价资料以及病毒灭活评价资料。
Ⅰ型胶原软骨修复产品的免疫原性的研究、评价与控制资料主要包括：免疫原性毒理学/临床相关文献数据资料、免疫毒理学试验资料、免疫原性风险相关的质量控制资料以及免疫原性相关不良事件资料等。应对热原进行控制，致热反应推荐采用家兔法。且应将内毒素水平控制列入出厂检验项目。对于通过提纯去除免疫原性物质的Ⅰ型胶原蛋白，可通过杂蛋白的含量指标进行控制；对于通过脱细胞工艺去除免疫原性物质的Ⅰ型胶原蛋白，应考虑残留细胞数量、残留DNA数量和/或残留α-Gal抗原的数量等指标。注册申请人应根据具体产品特性，考虑需增加的性能研究项目，如端肽、损伤相关的分子模式（DAMPs）、核酸降解酶以及特异性抗体检测，对于以上列举的项目中，如有不适用项，亦应说明具体理由。
在选择免疫学评价项目和设计试验方案时应充分考虑人与实验动物的种属差异。Gal抗原缺失动物可能是评价动物源性生物材料免疫原性的合适模型。如果结合“植入材料特异性抗体检测”，可以同时检测特异性抗Gal抗体之外的材料特异性抗体。Gal抗原缺失小鼠已被广泛应用于异种免疫原性评价。
在参考GB/T 16886.20分析选择体外免疫学试验时，要充分考虑样品制备的合理性，比如使用浸提液用于实验样品时要充分分析和证明抗原物质是否全部被有效浸提出来。应客观地分析实验体系的局限性。建议参考最新文献研究，合理选择体外免疫学试验方法，客观地评价异种免疫原性风险。
若产品采用常见的病毒灭活工艺，如有机物、射线、强酸等，其过程和方法相对成熟，申请人可采用文献或历史数据对病毒灭活效果进行评价，必要时针对申报产品开展病毒灭活试验验证。
鉴于产品主要成分为胶原，宜考虑病毒灭活工艺对胶原性能的影响，以及对产品有效性的影响。
4.4体外降解性能
适宜的降解行为对软骨组织修复具有重要作用，尤其需要关注材料的降解速率和软骨组织再生速率的匹配。
4.4.1宏观形貌变化
采用相机、光学显微镜等对降解不同程度的材料进行宏观形貌的表征。
4.4.2体积和质量的变化
将固定尺寸的水凝胶样品称重并标记体积，随后将其浸泡在 pH 7.4的 PBS溶液（或胶原酶溶液）中并转移至恒温摇床（37℃）， 在指定时间点 （如1、3、5、7、9、14和21天）取出，用滤纸擦掉样品表面多余水分，进行称重并测定样品体积。样品的降解率以质量变化率或者体积变化率表示，通过记录样品在不同时间点的降解率，获得其随时间变化的规律，分别计算质量和体积变化率。
4.4.3 力学性能变化
采用动态力学分析仪对不同降解时间点的胶原水凝胶样品，参考4.2.3中的项目进行力学性能表征。
4.5动物试验研究
4.5.1动物试验决策及设计
需按照《医疗器械动物试验研究注册审查指导原则 第一部分：决策原则》决策是否需开展动物试验研究。如开展动物试验研究，需按照《医疗器械动物试验研究注册审查指导原则 第二部分：试验设计、实施质量保证》进行，并遵循3R原则。需关注动物模型建立的科学性和合理性，以及对临床的借鉴意义。
对于I型胶原软骨修复产品，体内降解动物试验研究可与常规动物试验研究合并开展。I型胶原软骨修复产品的动物试验可以使用兔、犬、猪、羊等不同种属的动物模型，采用形态学、组织生物化学、生物力学分析等进行评价。动物试验方案设计宜明确的关键内容见本指导原则附录。
4.5.2实验动物模型的选择
实验动物模型应符合动物试验目的，建立合适的动物疾病模型用于研究，并详细说明选择实验动物模型的依据。实验动物数量应保证结果具有可靠性，并结合统计学考虑。如选择的实验动物模型对于产品应用于人体的安全性分析具有局限性，需对研究结果的影响进行详细说明。
研发产品的生物学效应、机械性能、降解周期、降解产物同组织的相容性及组织反应研究中，宜尽量选用符合相关国家/行业标准的实验动物，如兔、猪、犬、羊等。需要考虑I型胶原软骨修复产品的固定方式以及材料脱落风险。
4.5.3受试器械和对照品
注册申请人应对使用的受试器械和对照品进行详细的描述，包括产品名称、结构及组成（含配合使用的附件）、型号规格、使用数量、是否重复使用等信息。受试器械应为典型性产品，对照品宜优先选择已上市的同类器械作为对照品。适当时，动物试验中可设立阴性对照组和（或）空白对照组。
4.5.4动物试验持续时间
实验动物数量可结合研究目的、研究假设（如适用）、文献信息、同类产品经验等方面估计动物试验数量。受试器械组关键观察点通常包括至少6只可评价的实验动物。另一方面，建议预估动物试验数量时，考虑因各种原因导致实验动物过早死亡的情况。
动物试验的观察时间宜根据产品的预期用途，评价指标及降解周期选择研究持续时间，同时宜参考同类产品的研究情况。建议观察时间点为1m、3m、6m、12m或以上。动物试验应能观察到产品降解特征且应观察到产品完全降解、吸收，并且产品对靶组织及其他组织（如适用）的影响达到稳定状态。在研究中应选择多个观察时间点，其设定应有合理依据。
4.5.5评价标准
按照临床标准推荐的疗效指标进行评价，并表征产品的降解特征。
在动物试验中，应对实验动物进行完整的尸检，包括大体和详细的组织病理学检查，评估指标至少包括产品降解、组织再生等情况。建议评价指标详见本指导原则附录。
4.5.6动物试验方案和报告要求
动物试验研究方案和研究报告应至少包括但不局限于以下内容：
试验目的
试验器材或试剂
动物的种类、数量及该种类作为受试动物的合理性解释及
选择依据
试验方法（样品准备、动物准备、手术方法）、术前准备、
目标器官/组织、手术切口控制等
对照组类型和/或对照产品的类型和选取依据
动物模型的种类及建立方法
产品的使用步骤及时间
观察方法、观察指标与观察周期
数据统计学分析过程
结果判定标准与试验结论
有效性标准
安全性指标
试验研究的结论
4.6灭菌工艺研究
描述用于保证产品无菌的质量保证体系，明确灭菌工艺（方法和参数）和无菌保证水平（SAL）。I型胶原软骨修复产品的无菌保证水平（SAL）需达到10-6。
该类产品一般为灭菌包装交付，需提供灭菌工艺验证报告。对于经环氧乙烷灭菌的产品，需提供灭菌结果确认和过程控制报告，具体可参照GB 18279系列标准。
对于经辐照灭菌的产品，需明确射线种类、辐照剂量及相关的验证报告。需评价灭菌方法（包括不同辐照源）对于产品性能的影响，并提供验证性能的确定依据、验证方案及报告以及接受指标的确定依据，具体可参照GB 18280系列标准。
灭菌过程可对水凝胶或其他添加物质(例如赋形剂等)的性质产生影响。这些都宜在分析表征数据时加以考虑。在某种类别的水凝胶不适用常规灭菌方法时，宜在无菌条件下生产水凝胶,并考虑增加控制措施，例如参考药品《除菌过滤技术及应用指南》进行除菌过滤，提供相应的验证资料。需注意，经过滤的胶原溶液的黏度可能改变分子量，宜在除菌过滤验证资料中加以评估。
4.7稳定性研究
申报产品需参照《无源植入性医疗器械稳定性研究指导原则》提供产品稳定性研究资料。在此基础上，宜将水凝胶产品储存在温度和pH值可调控的环境中。
货架有效期验证资料中需要明确灭菌产品的包装材料、包装工艺及方法、加速老化试验或/和实时老化试验报告。加速老化试验中需明确试验温度、湿度、加速老化时间的确定依据，论证阿列纽斯方程中各项参数对凝胶组分的适用性，否则宜提供产品实时老化试验报告。若申请人提供其他医疗器械产品的货架有效期验证资料，则需提供其与本次申报产品在原材料、灭菌方法、灭菌剂量、包装材料、包装工艺、包装方式及其它影响阻菌性能的因素方面具有等同性的证明资料。不同包装、不同灭菌方式的产品需分别提供验证资料。
货架有效期的确定需建立在科学试验的基础上，如稳定性试验，其目的是考察产品在温度、湿度、光线、重力的影响下随时间变化的规律，为产品的生产、包装、贮存、运输条件提供科学依据，同时通过试验建立产品的有效期。因此，申请人在申报产品注册时，需对包装完整性和包装强度进行评价试验，如染色液穿透试验、气泡试验、材料密封强度试验、模拟运输等，同时需结合产品性能指标要求，提供产品有效期的验证报告及内包装材料信息。
申请人需提交运输稳定性验证资料，可依据有关适用的国内、国际标准和验证方案进行，如：产品包装的跌落试验、振荡试验等，提交运输稳定性验证资料，证明在规定的运输条件下，运输过程中环境条件不会对产品的特性和性能造成不利影响。
（四）临床评价资料
注册申请人需在满足注册法规要求的前提下，按照《医疗器械临床评价技术指导原则》的要求选择合适的临床评价路径提交临床评价资料。
本指导原则涉及的I型胶原软骨修复凝胶类产品为高风险器械，基于目前的审评经验，除《决策是否开展医疗器械临床试验技术指导原则》第三部分第（一）款中可考虑免于开展临床试验的情形，原则上此类产品需要开展临床试验。临床试验需按照《医疗器械临床试验质量管理规范》开展，并提交完整的临床试验资料。临床试验的设计可参考《医疗器械临床试验设计指导原则》。
申请人如有境外临床试验数据，可参照《接受医疗器械境外临床试验数据技术指导原则》的要求提交相关资料。
（五）产品说明书和标签样稿
1.产品说明书和标签需符合《医疗器械说明书和标签管理规定》和YY/T 0466.1《医疗器械用于医疗器械标签、标记和提供信息的符号第1部分：通用要求》中的相关要求。
2.说明书需告知使用者所有使用过程中相关的剩余风险。对产品预期使用者的技术知识、经验、教育背景、培训、身体状况以及产品使用环境（含工作条件）有要求的，在说明书中需予以明确。
3.当产品在临床使用时需与其他产品配合，应在说明书予以明确，研究资料中需有可配合使用的支持性资料。说明书中需提示，不应过度注射或植入材料，以避免在损伤部位产生张力。对于固定形状材料，说明书中需说明手术时是否可以进行切割修整。
（六）质量管理体系文件
按照《关于公布医疗器械注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》提交相关文件。
三、参考文献
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[34] ISO 13019, Tissue-engineered medical products---- Quantification of sulfated glycosaminoglycans (sGAG) for evaluation of chondrogenesis[S].
[35] ASTM F2212, Standard Guide for Characterization of Type I Collagen as Starting Material for Surgical Implants and Substrates for Tissue Engineered Medical Products(TEMPs) [S].
附录
I型胶原软骨修复凝胶类产品动物试验设计的关键内容
I型胶原软骨修复凝胶类产品动物试验方案中，宜至少明确如下方面的试验设计信息：
一、植入周期
在小型动物（兔）模型，植入6～8周可以提供植入物存留、修复类型等方面的信息；在大型动物模型，8～12周的研究周期可以提供生物相容性、早期细胞反应以及缺损内植入物存留等方面的信息，如果要基于形态学和组织生物化学的基础行判断关节软骨修复或再生程度通常需要8～12个月的周期。
二、缺损部位
人体透明关节软骨损伤常发生在膝关节，因此宜在动物模型中使用膝关节评价软骨修复。股骨髁、滑车沟和胫骨平台，以及同一关节面不同解剖部位的受力状态和强度显著不同，滑车沟可作为承受不同于股骨髁的载荷和剪切力的评价部位。
三、缺损大小
通过使用合适的器械，移除软骨和骨组织，而不过多损伤周围组织，形成软骨（全层或部位厚度）或骨软骨（全层和跨骨的）缺损。在一个关节表面可形成多个缺损以评价一个以上的植入物，然而应考虑多个缺损的大小和位置，以及对周围组织的影响。对每种动物而言，临界大小的缺损定义为动物不经干预能修复的最大尺寸（直径）缺损，每种动物的临界缺损大小通常不同。一般情况下，I型胶原软骨修复产品动物试验中，缺损模型宜不小于该动物的临界缺损，但也不应超过关节面积的15%～20%，或髁宽度的50%～60%。
四、对照组设置
动物试验宜包括阴性对照（空白缺损）和/或其他对照。在有已获批准的I型胶原软骨修复产品时，动物试验宜包括上市产品对照组。更多的动物试验方案设计可以参考YY/T 0606.10《组织工程医疗产品 第10部分：修复或再生关节软骨植入物的体内评价指南》。
五、评价指标
（一）大体观察
定期观察手术切口的红肿、有无分泌物、切口有无裂开、愈合情况、动物术侧关节活动情况。损伤部位修复大体情况，包括颜色、质地、表面光滑度、修复厚度、与周围软骨的整合情况、关节滑膜是否有增生等指标。
（二）影像学检查
如有需要可考虑参考YY/T 1636 《组织工程医疗器械产品再生膝关节软骨的体内磁共振评价方法》，通过影像学检查软骨及软骨下骨的修复再生情况。MRI无创性检查可用于体内软骨修复进度的监测。
（三）组织学切片
术后需设置不同的取材点，每个取材点试验组及对照组各取材至少6例，取出术侧关节，组织学切片染色进行新生软骨的定性及定量的检测，以及软骨下骨的修复再生情况。
（四）修复效果评分
采用国际软骨修复协会（ICRS）评估标准或改良的Wakitani评分法，按指标观察修复组织大体情况、基质染色、修复面积、软骨厚度及与正常组织的整合情况。分别计算试验组及对照组所有实验动物评分均值，进行统计学分析。
（五）免疫组化
观察点取材时可进行Ⅱ型、I型和X型胶原及蛋白聚糖的免疫组化染色，观察软骨再生情况，同时结合组织形态学结果，评价再生软骨组织肥大化和纤维化的情况。
（六）力学检测
观察点取材时进行聚集模量、动态刚度、泊松比、渗透性与摩擦系数等力学检测。
（七）糖胺聚糖 （GAG）含量检测
将力学测定的样品回收，取其修复区域软骨组织进行GAG含量检测，GAG含量检测参照YY/T 1810 《组织工程医疗产品 用以评价软骨形成的硫酸糖胺聚糖(sGAG)的定量检测》。
（八）免疫学指标
选择适当的观察点进行局部组织的免疫学检查，以及血生化的全身免疫学检查。
（九）安全性指标
动物试验研究中，建议对相关的不良事件进行观察。
