蛋白质免疫印迹法是基于蛋白质SDS-PAGE电泳分离和特异性抗体识别蛋白的特性，通过显色技术，以达到检测目的蛋白的技术。该技术广泛应用于定性检测蛋白水平的表达，活性分析与鉴定。

该实验步骤多，关键点多，耗时长，每个步骤可能都影响最终的结果，所以实验中经常出现各种问题。笔者根据个人实际实验操作中遇到的问题将从WB的配胶和电泳阶段分析问题原因或给出解决方法。

一、配胶阶段注意事项

配胶试剂管理：

应确保所使用的配胶试剂在有效期内，且试剂需清澈透明。若发现有沉淀或结晶产生，应及时进行更换。

2. pH 8.8的Tris-HCl和pH 6.8的Tris-HCl可能会出现沉淀，因此需根据需要选择合适的浓度（1.0M或1.5M）。同时，10%的SDS在低温（4℃以下）存放时容易结晶，而30%的丙烯酰胺则需要在避光且低温（4℃以下）的条件下保存。

APS（过硫酸铵）活性较强，室温下容易失效，建议进行分装后冷冻保存于-20℃。由于TEMED（四甲基乙二胺）挥发性强且有毒，因此需要在通风条件良好的环境下使用，避免长时间直接暴露在空气中。

操作技巧：

1. 在插入梳子时，应采用斜插的方式，以有效避免气泡的产生。

2. 为了防止胶条老化和干燥，电泳结束后，应将胶条置于实验台上晾干。如果胶条出现裂纹，可以使用保鲜膜进行覆盖，这样不仅可以防止胶液泄漏，还能延缓胶条的老化。

3. 最佳的操作方法是现配现用胶。如果需要保存，可以使用湿润的保鲜膜将胶包好，并放置在4℃的冰箱中。

常见问题分析：

1.漏胶问题：

原因分析：漏胶通常由于玻璃板未对齐、底部缺损、厚玻璃板边条密闭性不佳或塑料夹子过松所导致。

解决方法：在操作前，务必确保玻璃板干燥，以防潮湿影响对齐。在对齐玻璃板时，应使用一手的食指按压厚玻璃板的一侧上缘，同时用拇指按压薄玻璃板的同侧上缘，然后同时向下按压并锁定该侧的锁扣。接着，重复此步骤以锁定另一侧，确保玻璃板紧密对齐。

2.胶体未凝固：

原因分析：胶体未能凝固可能是由于APS或TEMED失效，或者在胶体未完全凝固时对其进行了移动。

解决方法：在制备胶体前，确认所有试剂的有效性，并严格按照正确的配比进行混合。如果配比无误但胶体仍未凝固，可以尝试增加凝固剂的用量或延长凝固时间。

3.胶体中存在气泡：

情况一：胶底部出现气泡，可能是胶垫材质或梳子插入不当所致。可改用实心软胶垫或添加保鲜膜。

情况二：梳子下缘出现气泡，解决方法是先插入一侧梳子再插另一侧。

4.拔梳子后泳道有胶丝：

原因分析：此问题通常是由于TEMED用量过多，导致胶体凝固过快。

解决方法：在制备胶体时，适当减少TEMED的用量。

5.拔梳子后泳道歪斜：

原因分析：泳道歪斜往往是由于梳子与玻璃板不匹配所致。

解决方法：在灌胶之前，务必先测试梳子与玻璃板的匹配度，确保它们能够紧密贴合。

二、电泳阶段注意事项

电泳操作要点：

1.确保上样一致性：

在进行上样时，必须确保每个加样孔的上样体积保持一致，这样可以避免蛋白条带出现水平不齐的情况。对于空置的加样孔，需要添加与样品等体积的1×loading buffer，以防止相邻通道的蛋白样品发生扩散。同时，上样时应缓慢添加样品，避免快速吹打导致样品溢出，且上样体积应控制在加样孔总容积之内。

2.电泳液的使用：

内槽需要被电泳液填满，而外槽则只需填至1/4处。对于不同厚度的玻璃板，上样量也有所不同。例如，1.0mm厚的玻璃板每孔最多可以上样20μL，而1.5mm厚的玻璃板每孔则可以上样40μL。

3.合理设置电压：

电压的设置需要根据环境温度来调整。在夏季室温较高时，应适当降低电压；而在冬季则可以提高电压。分离胶的固定电压应设为150V。在调节电压时间时，可以参考marker的位置。当marker分开时，表示蛋白已经进入分离胶。此外，在夏季高温时，可以将电泳槽放入冰水中进行降温，以防止凝胶发生变形。

4.常见问题分析：

1）电泳带扭曲或歪斜：

原因分析：这种情况通常是由于电泳液未加足够或发生漏液所导致。

解决方法：在电泳过程中，要及时检查和补充电泳液，以确保电泳槽内的液体保持足够的量，从而逐渐纠正电泳带的走向。

2）电泳带出现拖尾现象：

原因分析：拖尾现象往往是因为样本未能充分溶解。

解决方法：在进行上样前，务必确保样本已经完全溶解，这样可以有效减少拖尾现象的发生。

3）电泳带向两侧过度扩散：

原因分析：扩散过度通常是由于上样量过多所引起。

解决方法：应当适当减少上样量，以控制电泳带的扩散范围，保持电泳带的清晰度。

4）溴酚蓝呈笑脸状：

原因分析：当制胶试剂温度过高或制胶后未能及时保湿时，可能导致胶层不均匀，从而使得溴酚蓝呈现特殊的笑脸形状。

解决方法：在进行电泳时，应降低电压并调节电泳速度，同时确保电泳过程在冰浴条件下进行，以减少胶层不均匀的情况。

5）电泳条带不整齐：

原因分析：条带不整齐可能由于胶凝固不均匀、胶的下边缘存在气泡、上样buffer浓度不准确或在拔梳子时操作不当所导致。

解决方法：应等待胶完全凝固后再进行上样，以确保实验结果的最佳性；电泳前需仔细检查并清除胶底部的气泡；重新配置适宜浓度的上样buffer；在拔梳子时，应水平且缓慢地进行，以确保样品孔的均匀性。

6）电泳条带过粗：

原因分析：条带过粗可能是由于上样量过大、浓缩胶未能有效浓缩、浓缩胶的pH值不准确或电压过高所导致。

解决方法：应适量减少上样量；考虑增加浓缩胶的长度以提高浓缩效果；确保浓缩胶的pH值调整至正确的6.8；同时，适当降低电泳的电压。

通过严格遵守上述电泳阶段的注意事项，并不断优化实验流程，可以有效提升Western Blot实验的成功率，并确保实验数据的准确性和可靠性。