摘 要： 建立了超高效液相色谱-串联质谱同时测定河虾中地西泮和奥沙西泮残留量的方法。样品经乙腈提取，全自动MCX小柱净化，采用Shim-pack GISS C18色谱柱（50 mm ×2.1 mm，1.9 μm）分离，以甲醇-0.1%（体积分数）甲酸溶液为流动相进行梯度洗脱，在电喷雾离子源正离子模式、多反应监测模式下进行扫描检测，内标法定量。地西泮和奥沙西泮的质量分数在0.1～10.0 μg/kg范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均不小于0.999 3，方法检出限均为0.05 μg/kg。样品的加标平均回收率为83.1%～94.0%，测定结果的相对标准偏差为2.3%～7.8%（n=6）。该方法灵敏度高、准确度好，适用于河虾中地西泮和奥沙西泮残留量的测定。

关键词： 超高效液相色谱-串联质谱法； 同位素内标； 地西泮； 奥沙西泮； 全自动固相萃取

 

地西泮，又叫安定，属苯二氮卓类镇静催眠药，具有镇静催眠，促生长等作用。地西泮还作为动物增重促进剂在水产品养殖行业中广泛应用；但因地西泮及其代谢物在水产品体内残留对人体的毒副作用，而备受人们关注[1-4]。目前，测定食品中地西泮及其代谢物残留的方法主要包括酶联免疫法[5-6]、气相色谱法[7]、气相色谱-质谱联用法[8-9]、液相色谱法[10-11]、液相色谱-质谱联用法[12-16]等。虽然前四种方法在一定程度上解决了食品中地西泮及其代谢物残留检测的问题，但仍存在一些局限性。酶联免疫法易出现假阳性结果，而气相色谱法、气相色谱-质谱联用法和液相色谱法操作过程繁琐且灵敏度较低，因此这些方法不适合作为最终的确证方法。同位素内标-液相色谱-质谱联用法因具有补偿基质效应和提取过程损失、检出限低、准确度高、抗干扰能力强及样品无需衍生化等优点，广泛应用于食品中地西泮及其代谢物的残留检测[17-19]。由于河虾类样品中含有色素及蛋白质等复杂基质，采用传统的固相萃取可以达到良好的净化效果，但存在操作步骤繁琐耗时等缺点。相比之下，全自动固相萃取(SPE)具有可以自动完成从活化、上样、到淋洗、洗脱的全部工作，操作简便，极大提高了样品处理的效率[17-18]。

笔者建立了超高效液相色谱-串联质谱同时测定河虾中地西泮和奥沙西泮残留量的方法。采用全自动MCX固相萃取小柱净化，并运用同位素内标，对质谱条件和色谱条件进行了优化，适用于河虾中地西泮和奥沙西泮残留量的测定。

 

1、 实验部分

 

1.1 主要仪器与试剂

超高压液相色谱-串联质谱仪：TripleQuad-3500型，美国赛克斯公司。

超纯水机：Pure lab flex3型，英国威立雅有限公司。

涡旋振荡器：Vortex-Genie2型，美国科学工业有限公司。

高速冷冻离心机：TGL-20M型，湖南凯达科学仪器有限公司。

全自动固相萃取仪：EXTRA型，上海屹尧仪器有限公司。

固相萃取柱：(1)MCX型、C18 型，500 mg(3 mL)，德国CNW公司；(2)HLB型、MAX型、硅胶型，500 mg(3 mL)，美国沃特世公司；(3)中性氧化铝型、PEP-2 SPE型，500 mg(3 mL)，天津博纳艾杰尔科技有限公司。

地西泮标准溶液、奥沙西泮标准溶液、地西泮-D5标准溶液和奥沙西泮-D5标准溶液：质量浓度均为100 µg/mL，标准物质编号分别为1ST7102-100M-S114731、1ST8031-100M-S120001、1ST7102D5-100M-S126697、1ST8031-100M-S118659，天津阿尔塔科技有限公司。

乙腈、甲醇、甲酸：均为色谱纯，德国默克公司。

河虾样品：属于白绒河虾类，又称白绒虾，市售。

1.2 溶液配制

混合标准中间溶液：准确移取0.10 mL地西泮标准溶液和奥沙西泮标准溶液置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至标线，制得地西泮和奥沙西泮的质量浓度均为1 000 μg/L的混合标准中间溶液。

混合内标中间溶液：准确移取0.10 mL地西泮-D5标准溶液和奥沙西泮-D5标准溶液置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀释至标线。制得地西泮-D5和奥沙西泮-D5的质量浓度均为1 000 μg/L的混合内标中间溶液。

系列混合标准工作溶液：分别准确移取0.005、0.010、0.020、0.050、0.100 mL地西泮和奥沙西泮混合标准中间溶液置于10 mL容量瓶中，各加入0.010 mL混合内标中间溶液，用0.1%甲酸水溶液稀释至标线。制得地西泮和奥沙西泮的质量浓度均分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10 μg/L的系列混合标准工作溶液。该系列混合标准工作溶液中地西泮-D5和奥沙西泮-D5的质量浓度均为10 μg/L。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 色谱仪

色谱柱：Shim-pack GISS C18柱(50 mm×2.1 mm，1.9 μm，日本岛津公司)；进样体积：10.0 μL；柱温：29 ℃；流动相：A相为甲醇溶液，B相为0.1%(体积分数)甲酸溶液，流量为0.30 mL/min；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1   梯度洗脱程序

Tab. 1   Gradient elution program

 

1.3.2 质谱仪

离子化电压：5 500 V；离子源温度：555 ℃；气帘气压力：158.585 kPa；碰撞气压力：62.055 kPa；喷雾气压力、辅助加热气压力：均为372.33 kPa；离子源：电喷雾离子源；扫描模式：正离子模式；数据采集模式：多反应监测模式。地西泮、奥沙西泮及内标的质谱参数见表2。

表2   地西泮和奥沙西泮及内标的质谱参数

Tab. 2   Diazepam and oxazepam and their intrinsic mass spectrum parameters

注：*表示定量子离子。

 

1.4 样品处理

1.4.1 提取

参照SN/T 2113—2008《进出口动物源性食品中镇静剂类药物残留量的检测方法　液相色谱-质谱/质谱法》确定样品提取过程，流程图如图1所示。

图1   河虾样品提取流程图

Fig. 1   Flow chart of pretreatment of river shrimp samples

1.4.2 净化

采用全自动固相萃取(SPE)仪设定作业程序，具体程序见表3，利用MCX SPE柱进行净化。洗脱后，于40 ℃水浴中氮吹至近干。加入1.0 mL 0.1%甲酸溶液超声溶解残留物，过0.22 μm滤膜，滤液即为样品溶液。

表3   全自动固相萃取仪作业程序

Tab. 3   Automatic solid phase extractor action program

 

1.5 样品测定

取样品溶液，在1.3仪器工作条件下进行测定，以内标法定量。

 

2、 结果与讨论

 

2.1 质谱条件的优化

鉴于待测物的分子结构，选择在正离子电离模式下，对质量浓度为100 μg/L的地西泮和奥沙西泮及其同位素混合内标中间溶液进行一级质谱扫描。确定地西泮母离子峰(m/z 285.1)、奥沙西泮母离子峰(m/z 287.1)、地西泮-D5母离子峰(m/z 290.1)和奥沙西泮-D5母离子峰(m/z 292.1)。分别对上述母离子峰进行二级质谱扫描，找到地西泮两个主要二级碎片离子对为m/z 285.1，193.0和m/z 285.1，154.0；奥沙西泮两个主要二级碎片离子对为m/z 287.1，241.0和m/z 287.1，269.0；地西泮-D5一个主要二级碎片离子对为m/z 290.1，198.1和奥沙西泮-D5一个主要二级碎片离子对为m/z 292.1，246.1。地西泮和奥沙西泮分别选择相对丰度较大的离子对m/z 285.1，193.0 和m/z 287.1，241.0 作为定量离子对，再对所有找到的离子对进行质谱参数的优化，确定相应的去簇电压、碰撞电压等参数，得到较高灵敏度。

2.2 流动相的选择

鉴于目标分析物的酸碱性和电喷雾离子源的特性，在GISS C18色谱柱上，考察了20 mmol/L乙酸铵溶液-甲醇、0.1%甲酸溶液-甲醇、纯水-甲醇作为流动相体系时对灵敏度的影响。结果表明，在河虾加标样品中，20 mmol/L乙酸铵溶液-甲醇、纯水-甲醇作为流动相时，目标分析物的响应值较低且峰形较差。0.1%甲酸溶液-甲醇的流动相体系获得了最佳的灵敏度。在此流动相组成条件下，通过优化梯度洗脱条件，得到的化合物色谱峰为尖锐窄峰且峰形对称，因此最终确定0.1%甲酸-甲醇溶液作为流动相。

2.3 全自动SPE条件的优化

2.3.1 SPE柱的选择

为获得最佳的净化效果，结合待测目标物的化学结构特征，比较MCX柱、C18柱、HLB柱、MAX柱、硅胶柱、中性氧化铝柱、PEP-2柱7种SPE柱对目标分析物净化效果的影响，以回收率比较净化效果的优劣。不同固相萃取柱的目标物回收率如图2所示，从图2中可以看出，采用MCX柱进行净化，地西泮和奥沙西泮的回收率均高于采用其他6种SPE柱的回收率，因此采用MCX柱进行净化。

 

图2   不同固相萃取柱的目标物回收率

Fig. 2   Recoveries of target material in different solid phase extraction columns

2.3.2 洗脱液的选择

鉴于目标物是弱碱性化合物[19]，在全自动SPE装置上采用MCX柱进行净化时，分别比较了氨化乙酸乙酯和氨化甲醇作为洗脱液对回收率的影响。结果表明，以氨化乙酸乙酯作洗脱液时，地西泮和奥沙西泮的回收率均低于40%；而当用氨化甲醇作洗脱液时，地西泮和奥沙西泮的回收率均较高。在此基础上进一步比较了甲醇中不同氨水添加体积分数(0%、1%、3%、5%、7%、10%)作为洗脱液对回收率的影响，如图3所示。从图3中可以看出，甲醇中氨水添加体积分数为3%时，地西泮和奥沙西泮的回收率均高于95%，因此选择甲醇中氨水添加体积分数为3%作为洗脱液。

 

图3   甲醇中氨水不同添加量对应的目标物回收率

Fig. 3   Recoveries of target material corresponding to different addition amount of ammonia water in methanol

2.4 专属性试验

在1.3仪器工作条件下，对质量浓度为10 μg/L的系列混合标准工作溶液进行测定。地西泮和奥沙西泮的提取离子色谱图如图4所示，从图4中可以看出，地西泮、奥沙西泮混合标准溶液的质谱响应值高，其峰形尖锐且对称，地西泮、奥沙西泮的分子离子峰的相对保留时间分别是4.357、4.110 min。

 

图4   地西泮和奥沙西泮的提取离子色谱图

Fig. 4   Extraction ion chromatogram of diazepam and oxazepam

 

2.5 线性方程及检出限

在1.3仪器工作条件下，对7个质量浓度水平的系列混合标准工作溶液进行测定。地西泮、奥沙西泮均以其定量离子对的峰面积和对应内标离子对的峰面积的比值(y)为纵坐标，以标准溶液的质量浓度和对应内标的质量浓度的比值(x)为横坐标，绘制标准工作曲线，计算线性方程。参照HJ168—2020《环境监测分析方法标准制订技术导则》确定方法检出限，即分别称取7份粉碎匀浆后的河虾样品空白各2 g，均添加0.2 μg/kg的混合标准溶液，计算７次测定结果的标准偏差，以3倍标准偏差作为检出限，以10倍标准偏差作为定量限。地西泮和奥沙西泮的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限见表4。由表4可知，地西泮、奥沙西泮的质量分数均在0.1～10.0 μg/kg范围内与色谱峰面积线性关系良好，相关系数均不小于0.999 3，地西泮、奥沙西泮的检出限均为0.05 μg/kg，满足检测要求。

表4   地西泮和奥沙西泮的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

Tab. 4   Linear range，linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantitation limit of diazepam and oxazepam

 

2.6 加标回收与精密度试验

分别称取18份粉碎匀浆后的河虾样品空白各2 g，分别进行3个浓度水平(检出限、2倍检出限、10倍检出限)的样品进行加标回收试验，每种浓度平行制备各6份，在1.3仪器工作条件下进样测定，加标回收与精密度试验结果见表5。

表5   加标回收与精密度试验结果

Tab. 5   Results of standard recoveries and precision test

 

由表5可知，地西泮三个水平的加标平均回收率分别为89.5%、94.0%、93.6%，测定结果的相对标准偏差(RSD)分别为5.0%、3.6%、2.3%(n=6)。奥沙西泮三个水平的加标回收率分别为91.1%、92.5%、83.1%，测定结果的相对标准偏差(RSD)分别为7.8%、2.4%、4.5%(n=6)。表明该方法准确度、精密度较高。

 

3、 结语

 

建立了超高效液相色谱-串联质谱同时测定河虾中地西泮和奥沙西泮残留量的方法。采用全自动MCX固相萃取小柱净化，操作简洁，应用同位素内标降低基质效应和减少提取过程损失。该方法准确度高、灵敏度好，可适用于河虾中地西泮和奥沙西泮残留量的大批量快速测定。

 

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引用本文： 江恩源，朱国强，韦丽丽，等 . 超高效液相色谱-串联质谱法同时测定河虾中地西泮和奥沙西泮残留量［J］. 化学分析计量，2024，33（11）：107. (JIANG Enyuan, ZHU Guoqiang, WEI Lili, et al. Simultaneous determination of diazepam and oxazepam residues in river shrimp by ultra high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(11): 107.)